【国家标准(GB)】 谷物中T-2毒素的测定

ICS 67. 040
中华人民共和国国家标准
GB/T 5009.118—2008
代替GB/T 5009.118—2003
谷物中T-2毒素的测定
Determination of T-2 toxin in cereals2008-11-21 发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T5009.118—2008
本标推代替GB/T5009.118-2003《小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定（E1.ISA)》。本标推与GB/T5009.118—2003相比主要修改如下：修改了标准的中文名称，标准的中义名称改为“谷物中T-2毒索的测定”；-增加了高效液相色谱法作为第一法。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标推由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准参加起草单位：北京中检维康技尽有限公司。本标准主要起草人：隋凯、李军、卫锋、肖珊珊、杨春光、戚应春、阳传和、罗雪云、计融。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：CB/T149331994、GB/T5009.118—2003合品成伴网httn：
1范围
谷物中 T-2 毒素的测定
本标准规定了谷物中T-2毒素的测定方法。本标准适用于谷物及其制品中T2毒素的测定。本标准的第一法检出限为10g/k名，第法和第三法的检出限为1/kg。第一法高效液相色谱测定法
2原理
GB/T 5009. 118—2008
试样中的T-2毒素用甲醇-水提取后，提取液经免疫亲和柱净化，浓缩、衍生、定容后，用配有荧光检测器的液相色谱仪进行测定，外标法定量。3试剂和材料
除另有规定外，所用试剂为分析纯，水为蒸馏水或相当纯度的去离子水。3.1甲醛(CH.OH):HPLC级。
3. 2 乙腈(CH,CN):IIPLC级。
3.3中苯(C.HsCH).HPLC级。
3.4甲醇-水（8+2)：取80ml.甲醇，加20ml水。3.51-二甲基氨基吡啶（DMAP)溶液：准确称取0.0325g于100mL容量瓶中，用甲苯稀至刻度。3.61-鼠酸菌（1-anthroylnitrile,1-AN)溶液：准确称0.0300g于100mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。
3.7 T-2毒素(T-2 toxin)标准品：纯度≥98%。3.8T-2毒素标准溶液：准确称取适量的T-2毒素标准品，用乙晴配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液，一20℃冰箱中避光保存。使用前用乙稀释成适当浓度的标准T作液。3. 9 T-2 毒素免疫亲和柱。
3. 10玻璃纤维滤纸。
仪器和设备
液相色谱仪配有荧光检测器。
粉碎机。
高速均质器。
氮吹仪。
4.5离心机。
涡旋混合仪。
4.7空气压力泵。
玻璃注射器：20mL。
4.9天平：感最0. 0001g。
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GB/T 5009.118—2008
5分析步骤
5.1提取
称取试样50（精确到0.01g）于500mL玻璃混合杯中，加人100mL甲醇-水（8+2)，高速均质2min后，3000/inin离心寸min，上清液经定量滤纸过滤，移敢10.0ml.滤液并加人40.0ml.水稀释混勾，以玻璃纤维滤纸过滤，至滤液澄清后，进行免疫亲和柱净化操作。5.2净化
将免疫亲和柱连接于20ml.玻璃注射器下。准确移收10.0mL（相当于1.心g样品\）的5.1提取滤液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力便溶液以1mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直垒有部分空气通过杜体。以10IIL水淋洗杜子1次，充去全部流出液，并使部分空气通过杆体。加人1.5mL甲醇（3.1)洗脱，流速为1ml./min，收集洗脱液于玻璃试管中，50℃以下氟气吹千，得衍生。
5.3衍生
5.2净化后的样品中，分别加人50μL4-二甲苯氨基吡啶（DMAP)溶液和50uL1-鼠酸葱(1-AN)溶液，涡旋混合1min，于50℃±2℃.恒温水浴中反应15min，在冰水中冷却10min。50℃以下氮气吹干后。用 1.0 mL 的流动相[5.4,1b)]溶解,供液相色谱测定。5.4测定
5.4.1液相色谱条件
a）色谱柱:Cu柱,4.6×150 mm(内径)，粒度 5 μtm,或相当者；b）
流动相：乙腈-水（80+20)；
c)流速:1.0 mL/min;
d）检测波长：激发波长381nm，发射波长4170nm；c）进样最：20μ；
f）柱溢：室温。
5.4.2色谱测定
根据样液中T-2紊衍生含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中T-2毒素衔作物响世值均应在仪器检测线性范围内。对标推汇作熔报和样薇等体积参插进棉进行测定。在,上述色谱条件下,T-2 毒素衔生物的保留时间约为 9,8 min。T-2 素衔生物的标推色谱图见1
72毒资衍生物
图1T-2毒素衍生物的标准色谱图tmin
1）对于玉米赤霉烯酮含母较高的样品，可将提取滤液进行适当稀释，以保证玉米亦要烯酮的含量不超过免疫亲和柱的最大毒素负荷黄。
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5.5空白试验
除不加试样外，均按1述步骤进行。5.6结果计算
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用外标法按式(1)计算试样中T-2毒素衍生物的含，计算结果需将空白值扣除：X= 1. 000X(A- A)XcXV
1 000 XAs Xm
试样中T-2毒素衍生物的含量，单位为微克每千克(g/kg)样液中T-2毒素衍生物的峰面积；A
6精密度
-空白样液中T-2毒素衍生物的峰面积；标准工作溶液中T-2毒素衍生物的浓度，单位为微克毫升（ug/mL)；样液最终定容休积，单位为毫升（mL)；标推工作溶液中T-2寿素衍生物的蜂面积；最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。第二法间接法
7原理
将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加人一定量抗体与待测试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第一抗体结个物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原最。
8试剂
8.1 中醇。
8.2 石油醚。
8. 3 三氯甲烷。
8.4 无水乙醇。
8.5 乙酸乙酯。
二甲基甲酰胺。
四甲基联苯胺(TMB)。
吐温-20
8.930%过氧化氧(30%H,0)。
抗体:交瘤细胞系 1D7 产生的抗 T-2 毒素的特异性单克隆抗体。8. 11
抗原:T-2 毒素与载体蛋自-牛血清白蛋白(BSA)的结合物：8.12兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（酶标抗）。8.13EL1SA缓冲液系统。
8. 13. 1 包被缓冲液为 pH9. 6 的碳酸盐缓冲液,称取 1. 59 岛 碳酸钠(NaaC(),)、2. 93 碳酸氢钠(NaHCO,),加水稀释至 1 000 mL，8. 13.2洗液为含 0.05%吐温-20的 pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为FBS-T)。配制方法为:3
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称取0.2磷酸二氢钾(KH,PO4)、2.9g磷酸氢二钠(Na,HPO。·12HzO)、8.0g氯化钠(NaCI)、0.2氯化钾(KC1).0.5mL吐温-20,加水至1000ml.。8.13.3底物缓冲液为PH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：0.1mol/L柠檬酸（C.HsO，·H.0),即称取柠檬酸19.2g，加水至1000ml，为甲液；0.2mo1/L磷酸氢钠（NaaHPU），即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL为乙液；取甲液24.3tm.,乙液25.7mL，加水至100mL，即可。8.13.4底物溶液：取50μLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液十10mL底物缓冲液+10 μL30%过氧化氢.混匀。
8.14T-2毒素标准溶液：用甲醇配成1mg/mLT-2毒素贮备液，一20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度，
9仪器
所有玻璃器均用硫酸洗液浸泡，用白来水，蒸馏水冲洗，9.1酶标检测仪。
9.2酶标板（40孔或96孔)。
9.3电动振荡器。
9.4电热恒温水浴锅：
9.5其0.2ml.尾管的10ml.小浓缩瓶。分析步骤bzxz.net
10.1提取
称取 20 g粉藓并通过 20 且筛的试样，置 200 mL 具寒锥形烧瓶中,加 8 mL 水和 100 mL 三氯甲烷-无水乙醇(1-F1),密塞,振荡 1 h,通过滤纸过滤,取 25 ml 滤液了蒸发血中，置 90 ℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发血中残渣.洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇~水(4十1)分次洗涤，转人同一分液斗中，振摇1.5in,静置约15 min,收下层甲醇-水提取液过层析杆净化(层析柱的装备；在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1多脱脂棉,尽量塞紫，先装人0.5g中性鼠化铝，敲平表面，再加人0.4g活性碳,敲紧）。将过柱后的洗脱倒人蒸发血中，并于水浴锅上浓缩至干，趋热加3 nL乙酸乙酯，加热至沸，挥干,再重复·-次,最后加 3 mL乙酸乙酯,冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量Z酸Z乙酯洗涤蒸发Ⅲ,并入浓缩瓶中，将浓缩瓶置95C水浴锅F:，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供EI.ISA检测之用。10.2ELISA 检测
10.2.1用T-2-BSA(4ug/mL)包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。10.2.2酶标板用 PBS-T洗 3次，每次3tmin后，加人不同浓度的T 2标准溶被（制作标准曲线)或试样提取液(检测试样中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1十1，每孔100μL,该混合液应于使用的前一天配好,4 ℃过夜备用),置 37℃ 1 h。10.2.3酶标板洗3次，每次3min后，加人酶标二抗，每孔100μL，37℃1.5h，10.2.4同上述洗涤后，加人底物液，每孔100uL，37℃:30mi1。10.2.5用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。11结果计算
按式(2)计算：

式中：
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c—T-2浓度，单位为纳克每克（ng/g）；酶标板上所测得的 T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克(ug)；m
-试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；V
-滴加样波的体积，单位为毫升（mJ.)；Va.-
一样液的总稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）。
12精密度
在惠复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。第三法直接法
13原理
将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加人一定量的酶标记抗体与试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。
14试剂
14. 1 甲醇。
14.2油醚。
14.3三氯甲烷。
14.4无水乙醇。
14.5乙酸乙酯。
二甲基甲酰胺。
四甲基联苯胺(TMB)。
脏源-20，
14.930%过氧化氧(30%II,O）。
14.10抗T-2毒素单克抗休与辣根过氧化酶结合物。14.11抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物(T-2-BSA)。14.12ELISA缓冲液系统。
14.12.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（NazCO.）、2.93g碳酸氢钠(NaHCO,）,加水稀释至1000 mL
14.12.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.1的磷酸盐缀冲液（简称为PRS-T)，配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾（KHzPO),）、2.9g磷酸氢二钠（NazHPO,12H,O)、8.0g氯化钠（NaCI)、0. 2 g 氟化钾(KCl),0. 5 mL吐混-20,加水至 1 00U mL.15仪器
所有玻璃器Ⅲ均用硫酸洗液没泡,用自来水,蒸馏水冲洗。15.1酶标检测仪。
15.2酶标板（40孔或96孔）
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15.3电动振摇器。
15.4电热恒温水浴锅。
15.5具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶16分析步骤
16.1提取
称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200tnl.具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4-11），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置9G℃水浴上通风挥十。用50mL石油醚分次溶解蒸发血中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20tnL.甲醇-水（4十1)分次洗涤，转入同一分液澜非中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧）。将过柱后的洗脱液倒人蒸发血中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转人浓缩瓶巾。用适最乙酸乙酯洗漆蒸发血，并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅.I:，挥于冷却后，用含20%甲的PBS定容，供EI.ISA检测之用。16.2ELISA检测
16.2.1用1-2-BSA(4 μg/mL)包被嗨标板，每孔100 μL,4 ℃过夜。16.2.2标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加人不同浓度的T2标准溶液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样毒素含量）与抗体-酶结合物溶液（1+100)的混合液（1+1.每孔100μL.该混合液应于使用的前天配好,1 ℃过夜备用),置 37 ℃ 1. 5 ht。16.2.3酶标板洗3次，每次3min后,加人底物溶液。每孔100 μL,37℃30 min。16.2.4用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。17结果计算
按式(3)计算：
式中：
T-2浓度，单位为纳克每克(ng/g)；mt
酶标板上所测得的T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克（ng)；V
试样提取液的体积，单位为毫升(mL)；Ve-
滴加样液的体积，单位为毫升（mL)；D——-样液的总稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）。
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开本 880×12301/6
2009年3月第一版
2009年3月第：~次即刷
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