【农业行业标准(NY)】 奶牛胚胎移植技术规程

ICS 65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 14452007
奶牛胚胎移植技术规程
Procedure of embryo transfer technology in dairy cattle2007-09-14发布
2007-12~01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T1445--2007
为规范我国奶牛胚胎移植技术在推广应用中的操作，满足奶牛胚胎生产与销售的需要，依据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则》编写与本标准。本标握的全部技术内容为推荐性。本标准的阴录A、附录B、附录C、附录D、附录E附录F为规范性附录,附录G、附录H、附录1为资料性附录。
本标准由北京元集困有限责任公司提出，本标仙中华人民共和国农业部农垦局国口：本标准起草单位：北京奶牛中心本标主耍起草人：孙风俊张新慧薛建华吴胜权宜柏华赵鹏李艳华麻并測韩广文等。
1范围
奶年胚胎移植技术规程
NY/T1445—2007
未标痛规定了供体牛的选择、超数排卵、人下按、胚胎深集、胚胎质鼠馨定、胚胎冷冻保存与解冻、受体的选择与同期发情处理、胚胎移植等技术操作的基本原则、要求和方法，本标准适用于奶牛胚胎移植技，2规范性引用文件
下列文件中的条款通过术标准的引用而成为笨标准的祭款：凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各力研究是否可使用这些文件的最新版。凡是不注日期的引用文件，其最新版适用」不标谁，GB4143牛冷冻精液
NY/T34-20041奶牛饲养标准
3术语和定义
下刻术语与定义适用卡本标铺：3.1
直embryoiransfer,ET
胚胎移植
将体内外生产的奶牛早期肠胎移植到与其生理状态相同或相近的母牛子宫内,生产优良奶牛后代的技术。
4药品、器械和实验室要求
4.1试剂和药品
所用的试剂和药品及要求见附录A。4.2设备、器械与环境
4.2.1所需的设备与耗材：见附录B4.2.2器械、设备的清浩、消毒：见附录C4.2.3胚胎实验室：为胚阶操作专用,应保持室内无菌：无尘,室内温度保持在20℃-25℃；避免阻光直射。
4.2.4采胚究：为旺始采集专用,应保持清洁，地面要防滑，便于清洗、消，设有保定烂，与检胚室之间安装传递窗，室内温度不低于15℃。5超数排卵
5.1供体选择和超数排卵
5.1.1供体牛的选择
5.1.1.1供休牛应选择遗传性能稳定，系谱清楚，以及个体生产性能优良的奶牛。.5.1.1.2供体牛要求健康状况良好，体况中等以上，生殖系统和殖功能正常，无遗传和传染性疾病。5.1.1.3成年母「要有一胎以上的正常繁殖史,10岁以上的母牛一般不选作供体,声年母牛应在14月龄以上或达到成年牛体重70%以上：NY/T1445—2007
5.1.1.4趋排处翊时，供体牛应只有两个正常发情周期，卵巢发育止常、丰满有弹性，并有没育良好的黄体。
5.1.1.5筛选出的供体牛应在牛体上做好标记，仔细观察发倩，并记录H号和发惰时间。5.1.2供体牛的饲养管理
5.1.2.1供体牛饲养管理见NY/T34—2004c5.1.2.2应提供较高能量日粮标准，并运量补充背绿饲料、维生素A、维生素D、维生素F和微量元素
5.1.3超数排卵处理方法
5.1.3.1对于发情记录准确的供体母牛，以发情之为0d，在发情后的第9d~13d的任意一天开始连续4d肌肉注射促卵泡素（FSH），每天2次，间隔12h，在首次注射FSH后48h肌肉注射氧前列烯醉(PG)0.4mg/头·次。注射 PG 48h后观察发情，发情后12 h进行人工授精，
5.1.3.2对直检卵巢上有功能性费体的供体牛，可肌注PG0.4m/头·次，使其发情排卵，然后在发情后的第9d-13d进行肌肉注射FSH,具体方法同5,1.3.1.5.1.3.3诱导卵泡波同步发生方法进行超数排卵处理，即在发情周期的任意一人放人含孕激索的阅道栓，具体方法见附录D（规范性附录），同时肌肉注射17β雌醇5mg或苯甲酸钠燃.醇2m和黄体酮50mg-100mg。放阴道栓4d后（改阴道栓当关为0d)，开始连续4d肌肉注射FSII,每天2次，问隔12h在首次注射FSH后48h肌肉注射1G0.4mg/头次，再间厢12h撤检，注射PG后48h观察发情和人工授精：
5.1.3.4：般情况下，供休牛再复超排，每次处理应间隔60d左右；对于超排效果良好的个体，可来用5.1.3.3方法间隔30d左右进行超排处理。5.1.3.5不同FSH制剂应根据使用说明来确定用法利用量，使用新厂家或新批号的FSH时.应做超排效果预试验：进行重复超排时，应适当增加剂量。5.2供体牛的人工授精
5.2.1精液质量应符合GB4143的规定。人工授精使用的冷冻精液，应根据供体母牛选种选配的要求，选择遗传性状优良、系谱消楚、并经验证的种公牛冷冻精液5.2.2发情后12h进行第一次输精，每间隔12h输精一次，每次一支细管精液，共输精2～3次。5.3胚胎采集采卵)及处理
5.3.1胚胎采集时间
供体发情后第7d（发情当天为0d）采集胚胎。5.3.2胚胎采集
5.3.2.1麻醉
将供体个前高后低站立保定后，掏净直肠内的宿粪，可采用2%利多卡因在荐摊和第一尾问隙注射4mL--5mL,实施硬膜外腔麻醉，其他麻醉剂按说明书使用。5.3.2.2外阴清洗、消毒
麻醉后将牛尾拴系在牛体一侧，用消水冲洗会阴部和外阴周用，再用0.1%新洁尔灭或0.1%高端酸钾冲洗消毒，用灭菌纸巾擦于，最后用酒精棉球擦拭消蒂外阴部。5.3.2.3吸除子宫颈黏液
用黏液吸除器吸除子宫颈黏液。对青年母牛或宫颈通过困难的供体牛，可先用子宫颈扩张棒扩张子宫颈，再吸除子宫领黏液。5.3.2.4采胚
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通过直肠扭握，将带有钢芯的冲胚管经过了宫颈轻轻地插人一侧子宫角大弯处，抽山少许钢芯，再将冲胚管送到子宫角大弯前室小弯基部。给气充气，根据母牛年龄及子宫大小和冲胚管的深度确定充气量，一般声年牛充气8mL～10ml，经产为12mL~15ml固定冲胚管，抽出钢，元始灌注冲胚液，用前加温至37℃。冲胚液配制方法见附录E（规范性附录)。
采胚时，将冲卵液吊瓶挂在距外阴部1.0m高处，接通一通管（Y型）及冲卵管与集卵杯。根据子宫角的膨服程度确定冲卵液注入量的多少，一般罚次注人30ml.～50mL冲卵液，视液体回流悄况，然后反复多次冲满，每侧子宫角用液量300mL~500mL。冲完一侧子宫角后将钢愁再人冲卵管并放气，小心固定钢芯，把冲卵管退到宫体，转间插人另一侧了宫角，重复上述操作。
5.3.2.5采胚后处理
两侧子富角采胚完毕，向子宫体灌注抗生素（背需素80片和链霉素100方IU）或0.1%～0.2%碘甘油溶液30rnL~40mL。同时,肌肉注射PG0,4ng,在采胚2d后,再注射0.4mgPG。5.3.3检胚
5.3.3.1回驳液处理
5.3.3.1.1集卵杯法：用20G针头的流射器吸20mL冲胚液从上向下冲洗集卵杯内侧的尼龙网4次一5次，清除杯中的泡沫后镜检。5.3.3.1.2过滤杯法：冲胚时滤去回收液，最后将杯留下的20mL--30ml.回收液倒人，亦用少量冲卵液冲洗过滤杯2次～3次，一并倒入平血镜检。5.3.3.2镜检
将回收冲胚液的平血在10倍一20倍体视显微镜下，从上到下从左到右或从外到内Z罕形移动，用吸胚管（直径200(2m~300un)将找到的胚胎移人培养Ⅲ中的保存液小滴中，然后将同一供体母平的胚胎从液滴中全部吸出移到新液滴，并反复洗涤胚胎3次~5次。然后将体视镜放大系50倍以上，逊行胚胎质量鉴定和分级
5.3.3.3胚胎发育阶段分类
胚胎发育阶段分类应符合表1的要求。表1胚胎发育阶段和形态特征
胚胎发骨阶段
早期桑胚(Farly Marula,EM)
致密桑J(CurtHeLeri numula,CM)民期囊胚(Eerly blestocyst,EB)糖胚(Hastocyst, BL)
扩张囊胚(Expencded Ulaslxyst,FXR)孵化赛胚（ITatchingblaatocystHB）5.3.3.4胚胎发育日龄标准
形态特征
含有16个以上胞，卵裂球界限清晰，没有形成致密细胞团卵盈球选一步分裂变小，紧缩为团块状，看不消卵裂球界限，细胞凸据遵明带内的60%～70%空问
细胞团中出现散在的获胶，细胞团占据透明带内的70%--80%空间已经分化的滋养层和内部致密的、颜色发暗的内细胞困和溅胚腔明显是主要特征。滋养层与内细胞团的形态比较穿易区期。此时的胚胎纠胞充满整个透期带内
整个胚胎点径增大，囊脏腔充分扩张，与透朗带之向无同原，逻朔带变薄，人约最原来厚度的1/3
正处于孵化阶段的胎透明带破裂或胚胎细胞因正在脱出或者已脱离透明行3
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胚胎发育口龄标雅应符台表2的要求：表2胚胎发育日龄标准
胚胎发育阶段
卓细胞
2细胞
4-细胞
8-细胞
16-细胞
早期桑胚
驱殆日龄
5.3.3.5胚胎质量形态学鉴定及分级胚胎质量形态学鉴定及分级应符合表3的要求。5.3.4胚胎洗涤
5.3.4.1常规胚胎洗涤程序
胚胎发育阶段
致密桑菩胚
早期怀
扩帐装旺
蒋化凝还
5.3.4.1.1胚胎应用无瀚的保存液洗涤5次，每次洗涤不少于200叫。表3胚胎形态学鉴定及分级
胚胎目龄
7d--8d
脏胎发育阶段与胚龄一敏，透明带光清无缺陷，照胎细跑形态完禁轮廓清晰，师裂感大小均、结构紫漆色泽和透明度适中，光游离细胞或很少，变性细胞比例少于10%监治发育除段与胚龄基本一致、轮摩消晰，胚胎细胞团形态较完整，卵裂球人小基本一致，色泽和细胞透明度良好，变性及游尚细爬约占10%-~30%胚胎发合阶段与亚龄不太一致，后胚细胞团轮率不消，色泽和透明度变陷，卵裂球较松散游离，变性及游离细胞约占30%-50%，前用作不移拉未受精卵，或发育停溃变性、卵裂遂不则、少而散。D级不可时5.3.4.1.2
每组消洗胚胎数不能超过10枚。5.3.4.1.3每次清洗应更换无菌吸管，5.3.4.1.4每次消洗脏阶带入平Ⅲ中的液体量不能超过1%，5.3.4.2胰蛋白酶液洗涤程序
5.3.4.2.1每次消洗应使用新的灭菌吸管，5.3.4.2.2
每次清洗胚胎带人平血中的液体量不能超过1%。5.3.4.2.3每组清洗胚胎数量不超过10枚。5.3.4.2.4胚阶清洗前应有完的避明带。5.3.4.2.5用保存液洗涤5次！
5.3.4.2.6在0.25%胰蛋白液中(不含Ca、Mg离子的Har1k液）洗涤2次。在胰蛋自酶液中总的清洗时间60s~90s胰蛋户酶液配制方法见附录F。5.3.4.2.7再用含10%FCS的PES液洗涤5次。5.4胚胎冷冻保存与解冻
5.4.1甘油法冷冻
5.4.1.11.4ml/L(10%）甘油保护液的配制4
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取9mL含20%胎牛血清的·D-PRBS液，加人1mL甘油，用吸管反复吹吸混合15次-20次，经0.22um滤器过滤到灭菌容器内待用。5.4.1.2平衡
将胚龄直接移入10%的日油冷冻保存液，乎衡10min后，迅速装管冷冻。：5.4.1.3装管
使用0.25mL细管，装管前用胚胎冷冻液清洗细管内壁5遵。装管顺序是，一段甘油冷冻保护液气泡一段凸油冷冻保护液与胚胎，气泡；最后一段甘汕冷冻保护液（见图）。每支细管可装1枚或1枚以上胚胎。
5.4.1.4标记
甘油滤
甘油液+胚
廿油凝
标签鉴
装管后，采用聚乙烯醇粉或封口机封口，或用标签捕人封口端，标记内容：先单位（代号）标记品种和供体！号及种公牛号，胚胎发育阶段、等级及数量，胚阶生产时间等，乙二醇冷冻的胚胎应标记直接移植DT衍号。
5.4.1.5植冰
将装有胚胎的细管放人预冷至一6℃或一7℃的冷冻仪内，平衡5mi1后，用经过液赋冷却后的镜子夹任塑料细管封口端(远离胚胎端)植冰。5.4.1.6冷冻
植冰后，乎衡10min，以0.3℃/riain~0.5℃/nin速率降温，降到-35时，平衡10min，直接技人液氮中保存。
5.4.2.甘油法解冻
从液氮中取出细管，在空气中停臀10s;然后投入35C水浴中解冻10s用酒精棉球消毒、用灭菌纸巾擦干。用细管剪刀剪去封口端，推出细管中的胚胎，在1mal/L燕糖液中平衡4Inia~10min，然后将胚胎转移至保存液中洗涤5遍，胚胎质量鉴定合格后装管移植：5.4.3艺二醇冷冻胚胎直接移植法程序5.4.3.1将胚胎放人1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷冻保护液巾，买衡10min，迅速装人0.25mL细管。装管顺序：乙三醉液，气泡，含有胚舱的乙…醇液，气泡，乙二醇液，封口。见下图；塞
Z二醇液
二碎液+蓝略
乙二醇液
封处标签管
5.4.3.2植冰：胚胎放人-6℃或-7℃冷冻仪平衡5min后用经过液氮冷却后的镊子夹住料细管封口端(远离胚胎端)植冰。
5.4.3.3冷陈：植冰后，乎衡10mit,以0.3℃/nin0.5它/mnin速率进行降温，达到--32℃--—35心时，平衡10min，把细管投人液氮中。5.4.3.4解冻：从液氮中取出细管，空气中停留5s，投入32水中，待冰晶消尖后取山细管，用酒精棉球擦十、消高后，剪开封口，直接装入移器，进行移植。6受体牛的选择及胚胎移植
6.1受体牛的选择与管理
要求体型较大，情适中，发情周期正常，生殖系统无疾忠。青代牛16～18月龄以上；成母牛2~·6S
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周岁，产后2个月以上。产续性能和乳性能良好，无流产史。受体牛样的饲养管理和供体牛同样重要，给予充足清洁的饮水和是够的卓料。6.2受体牛的同期发情处理
6.2.1前列腺素(PG)法
第1次注射第1次注射
成母车
古年母牛
天数d
第2次注射
成理牛和背年母午
观察发待
注：青年母牛两次注射G间陷11d;般存牛注射PG间隔13d或14d。6.2.2阴道栓结合PG法
雌激索+阿道格
天数od
6.3胚胎移植
6.3.1准备工作
注射 PG
取出阴道栏
观察发情
10a~11d
6.3.1.1器械利药品：器械包括胚胎移植枪、无菌塑料硬外套、无菌塑料软外套、剪毛剪、细管剪、温度计-解冻杯、次性注射器等，药品有2%利多卡因、0.1%新洁尔、70%酒精棉球等：6.3.1.2受体牛的准备；根据发情记录，确定待移植的受体牛，并做育肠检查，确定排卵侧有功能性黄体，子宫形态和质地正常。移柏前用2%利多卡因实施硬膜外腔麻辟，对外阴部用（.1%的新洁尔火溶液清洗消毒，用酒精棉球操拭消牵，并用纸巾擦干。受休牛发情后天数与版龄相差不应超过土1。6.3.1.3肝胎的准备：根据受体牛的发情后天数选择胚胎的发育阶段；般将致密桑禁胚、早期囊胚利胚，分别移植给发情后6d、7d和8d的受休母牛，然后将H油作冷冻保护剂，冷冻的胚胎按5.4.2要求解冻后，装人0.25mL细管，再装人移植枪，套好保护外套备用；乙二醇作冷冻保护剂的冷涨胚胎按5.4.3.4要求解冻后，直接装人移植枪，套保护套备用。6.3.2移销操作
分开外阴部，摘人移植枪，至子宫颈外口，另一只于通过直肠把搬子宫颈，移植枪顶开软外套，进入了宫颈。轻轻地将移植枪前端送达有黄体侧的子宫角上1/3处，推入钢芯，将胚胎推入子宫内，然后抽出移植抢。整个操作过程要认真细致、柔和，防止造成了宫内膜出血。7记录
7.1供体牛超排采胚及脏淤冷冻记录表见附录G。7.2同期发情记录见附录H。
7.3受体牛移档记录见附录T，
A,1 试剂和药品的要求
附录A
【规范性附录】
试剂与药品
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A1.1所用的试剂除特殊规定外，包括氯化钠(VaCI)、氯化钾（KCI)、磷酸氢二钠（NazHPO,）、磷酸二氢钾(KHP()）氯化钙（CaCz)）：氮化镁（MgCl2)以及葡萄糖、内酸钠、甘油、乙一醇等，均为分析纯及其以上纯度的化学试剂。
A，1.2冲胚液、保存液、冷冻保护液和解冻液等使用的血清、牛血清白蛋白HSA)和抗生素应符介组织培养要求。胎牛-血清（FCS)使用前需经过质量检测，无菌、无支原体、无病毒和内毒索；肉眼观察呈淡黄色，澄消透明，无杂质。使用前需置于56℃的水浴锅中火活30min，在一20℃～-70C冷冻保存，用前解冻并过滤：
A.2同期发情、超数排卵和胚胎采集所需药品和溶液A.2.1同期发情和超数排卵所需要的药品和激素A.2.1.1 5%--10% 碘酊。
A.2.1.20.1%新洁尔火，wwW.bzxz.Net
A.2.1.3生理盐水溶液。
A.2.1.4促卵泡案(FSHI)。
A,2.1.5前列腺素PG)玻其类似物：A.2.1.6激素(P4)。
A.2.1.7 雁二醇(Hg)。
A.2.2胚胎采集所需药品和溶液
A.2.2.1 5% ~-10%碘。
A.2.2.20.1%新洁尔灭。
A.2.2.3生睡盐水溶液。
A.2.2.42%利多卡因或2%普奔卡因等A.2.2.5青霖素和链霉素。
A.2.2.6改进的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS)、冲卵液、保存液、冷冻液等，配方和配制方法见附录E。NY/T 1445-2007
附录B
【规范性附聚】
设备与耗材
B.1超数排卵，人工授精和胚胎移植所需器材B.1.15mL、10mL.20ml.50rmL一次性注射器及头。B.1.2牛用开腹器。
B.1.3CIDR放置器。
牛用输精枪输稍枪塑料硬外套：输精枪塑料软外您膜。B.1.4
B.1.5胚胎移植枪；移植枪塑料硬外套；移植枪塑料软外套膜。B.1.6解冻杯、温度计、剪毛剪等，B,2胚胎采集所器材
冲卵管（路式），16--18#用于青年牛，20*用于经产母牛。B.2.2冲卵管内钢芯：
B.2.3于宫颈扩张棒。
子宫领黏液吸除器
5三通管。
B.2.6二通管，
B.2.7硅胶管：
320nL注射器。
1ml.注射器。
5mL注射器。
集卵漏斗或底部郡格的过滤式集卵杯。B.2.12
肖径35mm和言径100mm的培养Ⅲ，B.2.13
剪毛剪。
B.2.141000 ml容量瓶。
B.2.15封口膜，70%酒猜棉球，
B.3胚胎处理、鉴定和冷冻保存所需设备和器材B.3.1休视显微镜10×~100×
B.3.2电热恒温盘或恒温板。
B.3.3直径35mm、直径100mm的培养血，B.3.4胚胎吸管、微量移液器。
B.3.5脏胎程控冷冻仪。
B.3.60.25mL塑料细篮。
B.3.70.22um针头式过滤器。
B.3.8细管塞
B.3.9塑料游膜封口机
B.3.10标签记号笔。
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C.1器具洗涤
c.1.1玻璃器血的洗涤
附录C
【规范性附录】
器具的洗涤与消毒
C.1.1.1没泡：新购置的坡璃器血使用前应先用白来水简单刷洗.然后用5%稀盐酸溶液没泡121以上；培养后的玻璃器血用后要立即浸入清水中，不应留有气泡，C.1.1.2刷洗：浸泡后的玻璃器血用毛刷沾洗涤剂洗涤（宜选用软毛刷和优质的洗涤剂，如高级洗衣粉或洗洁精）洗刷，洗谢时用力要轻，防刮底，防死角。或用超冲波洗涤器洗涤20min--30min，水中册人洗涤剂。
C.1.1.3浸酸：对于含有污垢以洗刷的器血要先在清洗液中（勿留气泡）没酸。浸酸时间不应少于6he
C.1.1.4冲洗：刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹，冲洗宦用洗涤装置，以保证冲洗效果，如用手工操作，每瓶都得用水灌满，倒空，重复10次以上，最后再用蒸增水漂洗2次～3次，晾于备用。
浸泡/清洗液配方：
【强液】重铬酸钾63g
浓硫酸1000mL
蒸馏水 200 L
【次强液】重铬酸钾120
浓硫酸 200 mL
蒸馏水「000 mlL
【弱液】重铬酸钾100g
浓硫酸 100 ml,
蒸馏水100 mL
矽酸钠洗液：
先配制成100×贮存液：这酸钾80g：偏磷钠9g，加热溶解在1000mL蒸馏水中，使用时，用热馏水100倍稀释：
C.1.2胶塞的洁洗
C.1.2.1新购宵的胶塞先用白来水冲洗干净后，再做常规处理。C.1.2.2常规处理方法：漫泡，2%NaII煮沸10min20mil，自来水冲洗烘干后，1%稀盐酸浸泡30mim，自来水冲洗和蒸馏水各清洗2次3次，晾十备用。C.1.3塑料器血的清洗
培养使用的塑料器肌是一种光毒并已经消毒过的灭菌密封包裂的一次性使用物品。用时，只要打开包装即可。集卵杯、冲卵管等可重复使用物品用后应立浸人水中，并用流水冲洗丁净，晾十。(.2器具消毒
紫外线消毒
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