【国家标准(GB)】 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS 67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T20756—2006
可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of chioramphenicol,thiamphenicol,andflorfenicol residues in edible animal muscles, liver and aquatic products-LC-MS-MS method
2006-12-31发布
中华入民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2007-03-01实施
本标准的附录A和附录B为资料性附录，本标准用中华人民共和国秦呈离出入境检验检疫局提出。本标准出叶华人民共和国国家质累监督检验检疫总局归口。GB/T 20756—2006
本标准起草单位中华人民共和国秦皇岛山入境检验检疫局、中华人民共和国广东山人境检验检疫局，
本标准主要起人：庞国芳、林海丹、林峰、焦红、陈捷本标准系百次发布的国家标准。1范围
可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T20756—2006
木标雄规定了可食动物肌肉、肝脏、色和虾巾氟霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的液相色谱串联质谱测定行汰：
本标唯适用于可食动物肌肉、肝脏、鱼利虾中氯霉素、中霉素和氟苯尼考残留量的测定。本标准方法的检山限：氯霍素为0.1μg/kg.甲讽需素和氟举尼考为1.0ug/kg：2规范性引用文件
下列文件中条款通过本标准的引用而戒为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修收单(不包括期误的内容)或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓励根据木标推达成协议的各方研究是否可使用这些义件的最新版本。凡是不注H期的引用文件.其最新版本适用于本标准。GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(G3/T 6379. 1—2004,JSO) 5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（止确度精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2—2001.1SO57252:1994,1DT)GB/T6682分析实验室用水规格租试验方法（GB/T66821992.neIS0）3696：1987）3原理
品中的氯霉素、甲矾毒素和氟苯尼考在喊性条件下，用乙酸乙酯提取·提取液旋转蒸「后，娥渣用水溶解，经正已烷液液分配脱脂。液相色谱-串联质谱仪检测4试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.水为G13/T6682规定的一级水。4.1甲醇：也谱纯，
4.2乙酸乙。
4.3正已烷。
4.4氢氧化铵：25%-~28%
4.5无水硫酸钠：经650℃灼烧4h.置于干燥器中备用。4.6氯霉素，甲砜霉索氟苯尼考标准物质：纯度含99.5%4.7氛代氯索内标标准溶液:100 以店/mL4.8标准储备溶液：100 μg/ml.。分剂准确称取适量的氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考标准物质.用甲醇配成100\g/m1.的标推储备溶液，该溶液于18℃保存，川使用1年4.9混合标滩储备溶液：1g/mL：分别催确吸取1L氣霉素，中矾霉素和氟苯尼考标准诺备溶液(4.8)丁100mL.容最瓶中，用甲醇薪释至刻度，该溶下一18℃保存,可使用6个月4.10中间浓度混合标准溶液:20 ng/inl，准确吸取1ml.混介标准储备溶液（4.9）于50 ml.容量瓶中，用水稀释至刻度。该溶液于4℃保存，可使用3个月。GB/T 20756—2006
4.11内标标准储备案液：1 Pg/ml.。准确吸取100 ul.代霉索（d：氯霉素）标准溶液（4.7）丁10ml.穿量瓶中.用甲醇稀释至刻度。该溶液下18℃保存.可使用6个月。4.12中间浓度内标溶液:20 ng/rrL，准确吸收：ml.内标标准储备溶液（.11)于50tml.容量瓶巾，用水释至刻度。该济液于1℃保存，可使用3个为。4.13基质混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏和仪器线性范用.吸取一定量的中间浓度混合标准溶液（4.10)利中问浓度内标溶液（4.12）.用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准1.作溶液，内标浓度均为0./m当天配制
4. 14滤膜:0. 2 μm。
5.1液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离了源，5.2分析天平：感量0.1mg利0.01g5. 3 离心机;4 000 1/min.
5. 4高逆台式离心机：13 000 r/min5.5组织捣锌机。
5.6 勾质器。
5.7旋转蒸发器
5.8超声波。
5. 9液休混匀器,
聚丙烯离心管：50 mJ.,1.5ml.,H萃。5. 11鸡心瓶:25 mL
5. 12比色管:50 tml.,其塞
6试样制备与保存
6.1试样的制备
收样品约590用肉类组织鹅碎机绞碎，装入洁净容器作为试样，密封.并标明标记。6.2试样的保存
将试样于18℃冰箱中保存：
7测定步骤
7.1提职　
称收5试样，精确至0.01：宵于50ml.聚丙烯离心管巾，如入中间浓度内标溶被（4.12）75.0 μl. 加人15 ml.乙酸乙酯,0. 45 mL 氢氧化铵（4.).5 g.无水硫酸钠,勾质提墩 30 s,以 000 r/imin离心5min，上清液转移全50ml.比色管中。另取个50ml.离心管，加人：5ml.乙酸乙酯，0.45ml氢氧化铵，洗涤勾质刀头10$，洗涤液移人第一支离心售中，用玻棒搅动残渣，于液体混勾器（5.9）上涡旋取lmin,超声被提取5min以：n00r/min离心5min，1清液台并至50inl比色管巾。残渣再人 15 ml 乙酸乙酯、重复1:述操作,合并全部上清液垒0 ml.比色管中,用乙酸乙酯定容至 50 rmL。摇勾后移取 10 ml.乙酸乙酯提取液于2tnL鸡心瓶中,在13℃旋转浓缩至干。7.2净化
鸡心瓶中的残渣用3mL水溶解，题声51rmin，训人3ml.正已烷祸旋混合30s，静置分层，弃掉上层的正已烷，再加3ml.正已烷涡旋混介30s，静置分层.移取1mL水机于1.5mL的聚内烯离心管中，以1 30c0 r/mim离心5 min.过 0.2 rm滤膜质:供液相色谱联质谱测定,7.3色谱测定
7. 3. 1液相色谱条件
色谱柱:Discavcry (is色谱柱,5 μin.150 mm×2.1 mm(内径)或相当者：a)
柱温：0℃
流动相：中醇→水(40+60)：
流速:0. 30 nT./niu:
进样量：20ml.
质谱条件
离子源：电雾离了源；
扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测(MRM);
电喷雾电压：1750V
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雾化气、气帘气、辅助加热气、避撞气均为高纯氮气及其他合适气体.使用前应谢节各气体流量e)
以便质谱荧敏度达到检测要求：f）
辅助气温度500℃：
g）定性离子对、定量离子对、采集附间,去电压改碰撞能量见表1。表1氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考和氛代氯霉素（d5-氣霉素）的质谱参数被测物名称及内标名称
氣舞索
甲破薇素
氟苯尼考
尔代氯挥紫(d:-氯霉素)
泛性离子对
329.0/257.0
329. 9/152.0
351. 0/290,
354.0/185.C
356.0/336.C
$5$,07.85.0
320.0/157.0
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
定量离了刘bzxZ.net
320. 9/152. 0
351. t/185. 3
356. 07336, 0
326.0/157.0
采集时间
去綫电压
— 55
避撞能量
每种被测组分选择【个母离子，2个以「子离子，在相同实验条件下，样品中待测物和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与标准溶液中对应的和对保留时间偏差在士2.与%之内：且样品中各维分定性离子的相对干度与浓度接近的标推溶液中对成的定性离了的相对丰度进行比较，若偏差不超过丧2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
充许的最大偏差
7.3.3.2定量测定
2 20 -~50
10--20
在仪器最佳1作条件下，对基质混合标准工作溶液（4.：3)进样，以标准溶液中被测组分峰面积和氛代氯霉素（d;-氯素）峰面积的比值为纵坐标，标准浮液中被测组分浓度与尔代氯霉素（ds-氯霉素）浓度的比值为描垫标绘制标准.1.作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范国内。内标汰定量。氯霉素，甲矾等素、疯苯尼考和氛代氯霉素（d氯霉素）的标雅物质的多反应监测(MRM)他谱图参见图A.1。氯霉素、甲矾霉索和氟苯尼考的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1
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7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样近行平行试验测定。7.5回收率试验
阴性样品巾添加标准溶液.按7.1~7.2操作，测定后计算样品添加的向收率。8结果计算
结果按式(1)算：
式中．
会x%x
试样中被测物残留量.单位为微克每千克（g/kg）：1000
基质标准下作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（.n/ml.)：试样落液中被测物的色谱峰面积：A
基质标准工作溶液中被测物的色谱峰而利：试群浴液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(1/mT.)：G
其质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每意升（Ⅱg/tnL）：基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容休积，单位为毫升(ml.)；试样溶液所代表试样的质量，单位为克么）。注：计算结来应扣除空白值。
9精密度
本标准的精密度数据是按照CB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9. 1重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r被测物的含量范围及重复性方程见表3利表4.
表3氧毒素，甲砜霉素和氧苯尼考的含量范围及重复性和再现性方程（基质为动物肌肉）化合物名称
氟苯尼考
含量范围/(μg/kg)
9. 053 6~-1. 00
0. 800---.00
0. 500-.4. 00
注：\为两次测守结果的算本平均值。重复性限
r-0. 07:m 1 0. 018 6
r-3. 252m - 5, 103
lger-.911 6lgm-0.618
再现性限R
K-0.1142m+0.0171
R=0.264+2.102
Jgh.5.916lgm—0.617
表4氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的含量范围及重复性和再现性方程（基质为动物肝脏）化合物名称
甲矾素
瓣苯尼号
含量范围/(μg/kg)
0. 050 C ~-1. 00
0. 500-.4.00
0. 500.-.4, )
注：m为两次测定结果的算术半均值复性限，
-- 0. 43m+0. c03 4
r-0.328n 0.187
r=0. 162m--0. 051 9
雨现性限R
R=0. 196m+0.004 9
R-0. 292m+0. 052 2
R2—0. 205m0. 236
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性
在再现性条件下，获得的两饮独次测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的含量范国放再现性方程见表 3 和表2.
附录A
（资料性附录）
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氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质和内标物气代氨霉素的多反应监测(MRM)色谱图氯霉素、中砜需素和氟举尼考标推物质和内标物充代氯露素的多反应监测（MRM)色谱图，见图A，18 000
0. 5 1. 1. 5 2. 0 2.5 3. 3. 5 4. 0 4. 5T/cmin
氟米尼号
0.5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 6 3.0 3.5 4. 0 4. 5/min
a 000-
年数得素
0.5 1. 0 1.5 2. 0 2.5 3.0 3.5 4.0 4. 5t/aiir
氛代氨母
0.5t.01.52.02.53.03.54.04.5
图A.1氛霉素、甲矾霉素和氯苯尼考标准物质和内标物代氟霉素的多反应监测(MRM)色谱图5
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附录E
（资料性附录）
回收率
氯霉素、甲碱霉素和氟举尼考的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.1表B.1氯再素、甲砜霉素和氟苯尼考的添加浓度及其平均回收率的试验数据（n=10）样品基质
化合物名称
甲砜毒素
氟求尼考
氟苯尼考
氣霉素
甲砜霉案
氮苯尼考
添加浓度g/kg
平均回收率（%)
样品基质
化合物名称
甲氮解素
氟莱尼号
表B.1(续）
添加浓度/（ug/kg）
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平均回收率光）
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