【国家标准(GB)】 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T 20752--2006
猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基肤喃类代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法
Method for the determination residues of the metabolites of nitrofuranin pork, beef, chicken, porcine liver and aguatic products-LC-MS-MS method
2006-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2007-03-01实施
本标准的附录A和附录 B为资料性附录，本标准由中华人民共和国桑呈岛出人境检验检疫局提出。本标由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总扇归口、本标起草单位：中华人民共和国案皇岛出人境检验检疫局。GB/T20752-2006
本标滩主要起草人：庞国笋、张进杰、曹座忠、郭彤彤、曹亚平，范春林、李学民、刘永明。本标准系首饮发布的国家标准。范围
猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中、硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T 20752—2006
本标准规定了猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中贝它酮（furaltadlone)的代谢物：5-吗嘛甲基-3-氨基-2-唑烷基（3-atnino-5morpholinomethyl-2-oxazolidinone：缩写为AMOZ）、呋喃西林（nitrofurazane）的代谢物氨基脲（sernicarbazide，缩写为SEM）、呋妥因（nitro-furantoin）的代谢物1-氨基-2-内酰腺（1-aninohydantoin，缩写为AHl)）和呋喃唑酮（furazolidone）的代谢物3-氨基-2-隧弹烷基酮（3-amina-2-oxazalidinone，缩笃为A()z）残留量液相色谱-串联质谱测定方法：
本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、氨基棘、1-氨基-2-内酰脲、3-氨基-2-嗯唑烷基甚酮残留量的测定。本标准方法的检出限：5-吗嘛甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、氨基腺、1-氨基·2-内酰骤、3·氨基-2-唑烷基酮的检出限均为0.5ug/kg。2
规范性引用文件:
下列文件中的案款通过本标准的用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GH/T:6379.1：测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总与定义(GB/T 6379. 1—2004,ISO 5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2：测最方法与结果的准确度（正确度与精密度）第.2部分：确定标准测最方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2—2001,ISO5725.2：1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992、neqISO36961987）3源理
试样中残留的硝基呋嘴类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，用QasisHLB或性能相当的固相取柱净化。电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测。用外标法或同位素标记的内标法定量，4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯
4,2乙腈色谱纯。
4.3乙酸乙酯；色谱纯。
磷酸氢二钾,K,HPO.。
4.5乙酸。
4. 6 二甲亚砜。
盐酸。
GB/T20752—2006
4.8氢氧化钠。
4.92-硝基苯甲醛(2-NBA),C,H,NOs:含量≥99%。4.10磷酸氢二钾溶液：0.1mo1/L。称取17.4g磷酸氢二钾（4.4)，用水溶解，定容至1000mL。4.11盐酸浴液：0.2mol/L。量取17mL浓盐酸（4.7)用水定容至1000mL。4.12氯氧化钠溶液：1mol/L。称取40g氢氧化钠(4.8)，用水溶解；定容至1000mL。4.13衔生剂：含2-硝基苯甲醛0.05mol/L。称取0.075g2-硝基苯甲醛（4.9)溶于10mL=甲亚砜（4.6），现用现配。
4.14样品定容溶液：10mL乙睛（4.2)，0.3mL乙酸（4.5）,用水稀释到100mL。4.15：四种硝基呋啸代谢物标准物质：呋喃它酮的代谢物5-吗嘛甲基-3-氨基-2-噬唑烷基酮(3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为AMOz），呋喃西林的代谢物氨基豚（semicarbazide，缩写为SFM)、呋响要因的代谢物1-氨基-2-内酰腺（1-aminobydantoin，缩写为AHD)和呋响唑酮的代谢物3-氨基-2-曬唑烧基喇（3-amino-2roxazolidinone，缩写为AOZ）标准物质，四种标准物质的纯度均299%
4.16四种硝基呋代谢物内标标准物质：5-吗琳甲基-3-氮基-2-嗯唑烷基酮的内标物，Ds-AMOZ；氮基脲的内标物，13C13N-SEM;1-氨基-2-内酰脲的内标物，1= Cs-AHD,3-氨基-2-嗯唑烷基酮的内标物，D,-AOZ。四种内标标准物质的纯度均≥99%。4.17.四种硝基呋喃代谢物标准储备溶液：1.0mg/ml。称取适量的四种硝基呋代谢物标准物质（4.15），分别用甲醇（4.1）释成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中，可使用六个月。
4.18四种硝基味响代谢物混合标准溶液：0.1g/mL。吸取适量四种硝基呋响代谢物的标准储备溶液（4.17），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中，可使用三个月。4.19四种硝基呋腩代谢物内标标准储备溶液：1.0mg/mL。称适量的叫种硝基哺代谢物内标标准物质（4.16），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中，可使用六个月。4.20四种硝基呋喃代谢物内标标准溶液：0.1μg/mL。移取适量的四种硝基呋喧代谢物内标标准储备溶液（4.19），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合内标标准溶液，避光保存于一18℃C冰柜中，可使用三个月。www.bzxz.net
4.21asisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL，使用前分别用5mI.甲醇和10mL.水预处理保持柱体湿润。
4.220.2pm滤膜。
5仪器
液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.1
5. 2 分析天平,感量 0. 1 mg和:0. 01 g各一台。5.3液体混勾器。
5.4固相萃取装置。
5.5氮气吹干仪。
5. 6 恒温振荡水浴。
真空泵，真空度应达到80kPa。
微量注射器：25μL,100μL
5.9棕色具塞离心管：25mL，50mL。5.10pH计：测量精度+0.02pH单位。5.11
波器：50mL。
离心机，转速4000r/min以上
试样的制备与保存
6.1试样的制备
实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出0.5k名作为试样。6.2试样保存
试样置于一18℃冰柜，避光保存。7测定步骤
7. 1混合基质标准校准溶液的制备7.1.1样品称取和脱脂
GB/T 20752—2006
称取5个阴性样品2g（精确到0.01g）分别置于50mL.棕色离心管（5.9）中，加人10mL印醇-水混合溶液（2+1），均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4U00r/min离心5min，吸取上清液弃掉。向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃代谢物混合标准浒液（4.18），使四种硝基呋响代谢物最终测定浓度分别为0.5ng/tniL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.Ung/mL、10.0ng/mL。再向每个离心管中加入适凰混合内标标准溶液（4.20)使四种硝基峡代谢物内标物最终测定浓度均为2.0ng/mL。
7. 1. 2水解和衍生化
向上述每个离心管中加人10mL0.2mal/1.盐酸溶液（4.11)均质1min，用10mL0.2tnol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加人0.3mL衍尘剂（4.13），用液体混勾器混匀，置于37℃恒温振荡水浴(5.6)中避光反应16h
7. 1.3净化
上述衔生溶液放置至室温后，加入5mL0.1mol/I.磷酸氮二钾溶液（4.10）,用Imal/T.氢氧化钠溶液（4.12）调节溶液pH约为7.4,4000r/min肉心10min，上清波（若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL正已烷，振荡2min1000r/min离心10min吸取并弃掉正已烷）倒人下接（)agigHI.B固相举取样(4.21)的贮液器(5.11)中，在固相辈取装置(5.4)上使样液以小于2miL/tuin的流速通过Oasis IHILB柱，待样液全部遵过固相萃取柱后用10mI.水洗涤固相萃取柱，弃去金部流出液。用真空泵（5.7）在65kPa负压下抽干OasisHI.B围相萃柱15min。用5 ml.乙酸乙酯(4.3)洗脱被测物于25mL棕色离心管中，使用氮气吹下仪（5.5），在40℃水浴中吹于，用样品定容溶液（4.14）搭解并定容至1.0ml.，混匀后过0.2μm滤膜（4.22)用液相色谱-串联质谱测定。7.2待测样品溶液的制备
称取待测样品：2g（精确到0.01.g），置于50mL棕色具塞离心管（5.9）中，加入10mL甲醇-水混合溶液（2+1），均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶洗漆均质器刀头，二者介并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉。向离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基吹嘴代谢物内标物最终测定浓度均为2.0ng/mL。按2.1.2和7.1.3操作。7.3阴性样品基质空白溶液的制备称取阴性样品i2g（精确到0.01g）.置于50mI.棕色具塞离心管（5.9)中，加入10mL甲醇-水混合溶液（2十1），均质1min，再用5mI.甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉。按7.1.2和7.1.3操作。7. 4定
7. 4. 1 液相色谱条件
a）色谱柱Atlantis-Cis，3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：35℃，
GB/T20752—2006
进样量：40μL
流动相及流速见表1。
时间/min
质谱条件
液相色谱梯度洗脱条件
流速/(uL/nin）
离子源：电喷雾离子源（ESI)：扫描方式：正离子扫描：
检测方式：多反应监测（MRM）
电喷雾电压（IS）5.000V：
辅助气(AUX>流速：7L/min:
辅助气温度（TEM)：480℃；
聚焦电压(FP)：150.V
避撞出口电压(CXP):11.V
0.3%Z酸水溶液/（%）
0.3%之酸乙蜻溶液/(%）
去簇电压（DP)：45V；
四种硝基峡嘴代谢物和内标衍生物的定性离了对、定量离子对，采集时间及碰流气能量质谱参数见表2。
表2·四种硝基肤瞻代谢物和内标衍生物的质谱参数衔生后的俏基呋啸代谢物
及内标物名称
5-吗啉甲基-3-氮基-2-噬唑烷基酮的衍生物(2-NP-AMOZ)
氨基腺的衍生物（2-NP-SEM）
1-氮基-2-内酰腺的衔生物（2-NP-AIID)-氨册-2-嗯唑烷基酮的衍生物（2-NP-AOZ)
5-鸣嘛甲基-3氨基-2-喂唑烷酮内标物的衍生物（2-NP-D-AMOZ)
氮基源内标物的衍生物（2-NP 1s crN-SFN)
1-氨基-2 内能脉内标物的衍生物(2-NP-I5 Ca-AHD)
3-氨基-2-曙唑烷基内标物的衍牛物（.2NP-D, -AOZ)
“定性离子对
335/291
335/128
209/192
209/166
249/134
249/178
236/134
236/102
340/296
212/168
252/134
240/134
定量离于对
(yn/z)
335/291
209/166
249/134
236/134
340/296
252/134
240/134
采集时间/ms
醛撞气能量/V
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1.定性测定
GB/T20752--2006
每种被测组分选择1个母离子，2个以1：子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质利内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准落液中对应的相对保留时间偏差在士2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标难校准溶液谱图中对应的定性离子的相对率度进行比较，者偏差不超过表3规定的范周，则可判定为样品中存在对应的待测物，表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子卡度
允许的最大偏差
7.4.3.2定量测定
2>20~-5C
内标法定量：用仪器软件中的内标定最程序-30~-20
外标法定量：在仪器最佳工作条件下，四种硝基呋哺代谢物的混合基质标准校推猝液迹样测定，以混合基质标逛校准溶浓度为横坐标，以峰面积为纵垒标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。四种硝基呋哺代谢物和内标物衍生物的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1，四种硝基映响代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表 13. 1。7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样逆行平行试验测定。7.6回收率试验
吸取适量混合标难工作溶液和内标标准工作溶液，分别按7:1.2和7.1.3衍生，浓缩；得到相应浓度的混合标推衍猝液和内标标准衍生溶液。用辈质空白溶液《7.3)稀释成所需浓度的标准校泄溶液。阴性样品中添加标准溶液，按7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。结果计算
结果接(1)式计算：
我中：
试样中被测组分残留量，单位为微克每T克（μg/kg）；从标推工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(g/tnL）：V一---样品浴液最终定容体积，单位为毫升（mL）-样品溶液所代表最终试样的质最，单位为克(g)。9精密度
本部分的精密度数据是按照GB/TB379.1和（B/T6379.2的规定确定的，重复性和再跳性的值以 95以的可信度来计算。
9. 1重复性
在重复性条件示，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。.四种硝基味喃代谢物的含量范围及重复性方程见表4.如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限。四种硝基呋代谢物GB/T20752—2006
的含量范围及再现性方程见表4。表4含量范围及重复性和再现性方程硝基呋喃代谢物的衍生物名称
5-吗甲基-3-氨基-2-嚼唑烷基酮的精4.物
氢基的衍生物
1-数基-2-内酰腺的衍生物
3-氨基-2-喝唑烷基酮的疗生物
含量范围/
(μg/kg）
0,2~2,0
0. 2~-2. 0
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限产
r-0.096 6 m+0.004 8
Ig rm1. 051 2 Ig m-:0. 980 1Ig r=1. 034 9 Ig m-0. 956 5
lgr-0.99191g站
再现性限R
Ig R=1. 170 7 Ig m: 0. 660 0Ig R=1. 000 2 Ig m-0: 884 8
Ig R-- 1. 008 a Ig m0, 894 9Ig R- 0. 827 8 lg m—0. 843 J附录A
（资料性附录）
GB/T 20752—2006
四种硝基喃代谢物及内标衍生物的多反应监测(MRM)色谱图四种硝基映喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测（MRM)色谱图.见图A.1，5
1 DO0-
5-鹦啉甲菌-3-氯基-2-1恶唑焕酮的衍生物15 t/min
氮萨瞬的衍生炮
敏-2-内成的衍牛物
2-深呼流的行牛袋
要性缩基附内标物的衍生物
氧造尿内标都抑舒生物
氨越-2-内酷原内标物的标生物
151/mln
16/amin
3-范基-2-随伴抗在剧内标的哲生物12
15 fmin
152/enin
E5 t/mim
15 rfmin
四种硝基喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测（MRM）色谱图GB/T20752—2006
附录B
（资料性附录）
回收率
四种基味喃代谢物平均添加回收率（n=10），见表B.1囊B.1四种硝基呋喃代谢物年均添加回收率（n=10)四种硝基呋响代谢物
衍非物名称
2NP-AMOZ
2NP-SEM
2NF-AID
2NP-AZ
添加浓度/
(μg/kg)
不同样品中四种硝基呋嘴代谢物的平均回收率/（%）牛肉
河豚鱼
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