【国家标准(GB)】 牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留量的测定 液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法

牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留鼻的测定液相色谱-紫外检测法和
液相色谱-串联质谱法
第一法液相色谱法
GB/T 20747—2006
本部分规定了牛和猪职呼安乃近优谢物单“基安替比林Inrmylamiuvantipyrire），d-甲基氨基安替比林(4-methiylanghnottianritle)和4-氨基安替比林(（a）Qingantipyrine）的液相色谱测寇方法。-甲麟氮基安替比林，4-甲基统替比崧和4-氨盐安替比林残留盘本部分适用干牛羽猪
的测定。
本部分的方法摊出限-印既
镇基安替比林为20ukg：
规范性引用变件
下刻文件可
鑫影通进本部
的修改单（不包据
课的内睿)或
是否可使用这紫医携的最新版本GB/T637测量方法
(GB/T 6379. 1+ 2001,1SO 5725GB/T 6372
墟方法与
性与再现性的基速剪港（GB/T6
GIB3/T6682分折实验室用膜
3原理
開而成为变部分的
制用件
果的准确度（正班度
确度正确质与精馆
604.150 5725
基安势比精为15.0g/kg，4-印基乳是注的期的引冠文件，其随后所有最励根据本部分达成协设的各方研究新版本道用事本部分。
密度）
第1部分总则与定义
第2部分确定标准测显方法重复
N932.neo Is0 3696:1987)
肌肉中安乃近代物晟留用酸钠溶波（P)提取，建聪得经BeElC固柏华取柱或相当4中氨基安替比林用外
者择化，用孕醇洗脱，就气
法残造用甲醇水溶解，供液树急谱必测定。标法定景、4-甲基氮基安着比和-氨瓣安替比林用内标法定盘试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯水为GB/T668规凝的一级水。4.1甲醇，色谱纯。
4.2乙:色谱死。
4.3硫酸钠。
4.4亚酸钠。
4.5乙酸铵：色谱纯。
4.6硫酸钠+亚疏酸纳凝取溶液：痛确称取14.2Gg无水硫酸钠和2.52亚硫酸钠，用水溶解，并使其体积达到约950mL.然后用0.5101/I.的稀硫酸调节溶波的pH值率7.0.用水定容至10001L。4.7淋洗液：串醇十水（5十95)。1
GB/T20747--2006
4.8样品定穿液：甲醇水（7+9）。4.94-甲基氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林标准物质：纯度≥99%。4.10内标标准物质：4-异丙基氨基安替比林（4-isoproylaminoantipyrine），纯度≥99%。4.11标准谱备溶液：100mg/L。准确称取邀量的各种安万近代谢物弥证物质（4.5）用中醇（4.1）配制成浓度为100r1名/L的标准借备溶液，避兆一18℃保存，可使用3个月。4.12混合标准储备溶液：10.0mg/L。吸收每种适盘标准储备溶液（4.11)，用甲醇稀释成10.0mg/1的混合标推工作辩液，避北一18℃保存，可使用1个月。4.13内标储各熔液：100mg/1。准确称取适量的内标标准物质（4.10)用中甲醇（4.1)配制成浓变为100mg/1内标储备熔液，避光一18℃保存，可使用1个月。4.14内标工作溶液：2.0mg/L。吸取适量的内标借备落液（4.13)，用甲醇稀释成2.0mg/mL的内标工作落液，避光一18*C保存，可使1个月4.15握會标准工作溶液：分别移取不同量混合标谨储备溶被（4.12)于进样瓶中，再分别加人适盘内标工作溶液（4.14），用样品定容救（4.8）定容室1tmL，使各被测组分的浓度均为0.010g/mI、0.050μg/mL.0.10μg/mL.0.50μg/mL、1.0μg/mL.2.0μg/mL.内棕物质浓度均为0.25μg/ml.。4.16BondElutC阔相率取柱或相当背：590mg，3inL。用前分别用5ml.甲薛和5mL水处理，保持持体湿润、
4.17继膜：0.45um
4.18璃滤纸。
5仪器
液相色浩仪：配有紫外检测器。5.2
周相举取教。
气液渐仪。
摘体混勾端。
分析天平：感梁0.1mg和0.67g：真密藜。
均所器。
滴：10~109租1001000m
桑闪烯离心管：50ml具寨.
F计微精度H单位
低温离心机：可制冷到4'C，
玻璃商心管：15ml.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取有代表性的牛或猪肌肉，制成实验窒祥品。试样分为两份，暨于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2试样保存
制备好的试样置乎一18℃冰柜中避光保存。7测定步骤
7.1提取
称取5g试样，确至0.01§。将上述样品于501mL聚矫离心管（5.9)中，加人0.25ml液度为2.0mg/T.的内标.作溶液（4.14)，然后加入15mL硫酸销十亚硫酸钠提取溶液（4.6），均质min2
GB/T 20747—2006
在10℃以4000r/min离心5min，将上满液转移到另个干净的50mL容整瓶中，残渣再分别加人15mL、10ml酸钠十亚硫酸钠提取溶液提取两次，离心后，合并上滑液，并用硫酸钠+业硫酸钠提取溶液定容至50mL，混合均勾，然后用玻璃滤纸过滤，待净化。72等化
取25mL提取液(7.1)效人C鹰相萃取准（4.16）中，以约1mL./min的流速使样液通过固相攀取社，待样液全部通过后，依次用5mL水和5mL甲醇十水淋洗液（4.7)淋洗固相萃取柱，弃去企部流出液，减压干固相萃取柱10ni。最后用5mL甲醇洗脱，洗脱被收集于15mL玻璃离心管中，置于氮气浓缩仪（5.3)上在55℃吹至近下，用样品定容液(4.8)定穿室1.0mL。定容激混句后，过0.45um谜膜，供液相色谱测定
7.3测定
液相色谱件
a）色谱柱：lnertsil(0DS-3色谱柱，5un，250mmX4.6mm或相当者：b）柱温：30℃；
进样量：50μ5
流动相、流速及梯度洗脱条件见表1：检测波长：20号tm
衰1梯豌洗脱条件
时间mir
7.3.2液相色谱測定
流遮/（m.2min)
水（%）
将混合标净工作溶液分别进样，以微既为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标证工作商线，用标准工作曲线对祥品进行定堡，样品溶较中4-甲酰领基安替比林、4-甲基氮基安替比林和4-酒能安替比林的响应值均应在仪器测定的绒性范固内。在述色谱条件下，4甲疯基安替比林的参考保留时问为J0.61i，4-氨安替比林的参考保留时间为13.60nin.4-球氨基安替比林的参考保留时间为14.76min，内标化合物的参考保留时间为17.55tnin。安乃近代谢物标谁物质的色谱图参见图A.1。4-甲融氨基安替比林采用外标法定股；4-甲基氢基安誉比林和4-氮翡安替比林采用内标法进行定量。本方法的添加国收率数据参见附录C。7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样逊行平行试验测定。7.5回收率试验
吸玻适量混合标准工作辫液和内标标准二作落液，用样品定容液（1.8）稀驿成所需浓度的标准工作溶液。阴性样品中添加标准溶液，按7.2操作，测定后计算样品添加的回改率。结果计剪
4-甲酰氨基安替比林结果按式(1)计算：x
GB/T20747—2006
武中，
X一--试样中被测继分残留量，单位为微克每干克(m/k);-从标雄作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ug/mL)：C
-样品裕被最定容体积，单过为凳疗（mL）m1-样品溶液所代奏最终试样的质量，单位为克(g)，4-甲基氨基安替比标和小~氨基安替比林结巢按武(2)计算：X
式中：
X一---试样中被测物残留量，单俊明窘克每干克（mg/kg）；基质标推工作溶液巾被测物的被度革位芳微究海毫升（μBL）：A—-试样溶液中被测物的倒湾面积基质标准工作落液够被测物的色谱峰面积；4.
试样溶液中内综物的度，单位为举克每毫升a-基质标准工作溶中内标物
A.-—批质标准连咨晟中内标
A——试样溶液计两豚物的色
V-一样孩最终定容体积单位露
试样溶液所表试单的廊
注：计莫结果应徐客再值，
精密度
本部分的精密境数被足按照
以95外的可信度求将计算
题复性
在重复性条件
复性方程见表2。
得的两独
奶果差值超过重复性限应舍剂
9.2再现性
避为克
症确定的，重复性和巧现性的值性限,被测物的含冠范围及重
金的测定
在再现性条件下，获得的颜法独立测试结果的绝对差值不超过再现佳限良，被泌物的含量范困及再现性方程见表 2。
含邀范围及重复性和再现性方程化合物名称
A-甲酰氮甚安替比焱
4~氨基安替比球
4-甲基基安巷比林
4-甲氮基安替比林
4-氨装宽蓉比忧
4-单驱然安替比林
含边范国
(μg/lkg)
50-~400
50---40
50~1(010
50--200
50~~400
50-100
注：n为两欲认定结聚的算术平的，4
敏變性限
Igr=0. 388 8 igm+ c.029 1
lgr=0, 323 0 1gm+ 0, 050 4
1g=0. 720 59 1gm1 --0, 659 1lr=0, 628 8 1gm--0, 452 6
Igr- 0. 448 G 1g--0. 103 5
Igr-0. 480 0 lgm-0. 184 5
雨现性畏R
Igr=0. 681 7 1gm-0. 578 2
Igr=0. 639 6 1gm—0. 531 5
Igr=0. 9h1. a Igm-1, 135 7
Igrm0, 588 8 lgm -0, 406 3
Igt=0. 553 9 lgw1 -- 0. 373 31gr=0. 789 0 lgm--0. 749
1门花
第二法液相色谱-串联质谱法
GB/T 20747--2006
水部分规定了华和猪肌肉中安乃近代谢物4-甲酷基安替比林（4-formylaminoantipyrine）4-乙氨基安替比林（4-acetylaminoantipyrine），4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine）和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)的液相色谱-串联质谱测定方法。本部分适用于牛和猪肌肉中4-甲醚氮基安替比林、1-乙酰氨基安替比林，4-甲基氨基安替比林和4-基安替比称残留量的测定
本部分的方法检出限：4-甲酸氢基安替比林为1.8ug/kg4-氨基安替比林和4-甲基氮基安替比林为1.5ug/kg，4-乙酰氮激安替林为1.0g7kg。11规范性引用文件
下列文件中的条款遍过
分的引用
的修改单（不包活勘误的即容或偿设是咨可使用这监文件缸最新版本。GB/TB379.1测量方法与
(GB/T 6375. 1-2004,ISO 5725-1GB/T6379.，测影方法与结
性与再现性的瑟本
GBr G37
GB/T6682美然折实验室用水夏
12原理
肌肉中安乃近代谢物残留用硫
者净化后，用甲酵洗脱嫩气吹干。法定遗。
13试剂和树料
药本部分航
留皮（正确度与精劳
和计法（C82
喜（pH
+水溶裤，传
凡是注凰期的用文件，其随后所有励根据馨部分达放协议的各方研究版本适用于本部分。
第1肇分：总则与定义
2部分：确定标经测蛋方法画夏
2,1e ISo 3696:4987)
130idFla周翻萃取柱或相当
露串膜质谱议测定，内标法或外标除另有说明外.所用试剂均为分析纯，水为GB6682视定的13.1
甲班：伴曾纯。
艺瞻：色谱纯，
13.3硫酸钠。
亚硫酸钠。
13.5醋酸铵，色谱纯。
13.6硫酸钠一亚蔬酸钢凝取溶液：准确称取14.20g无水硫酸钠和2.52g亚硫酸钠，用水溶解：并使其体积达到约950mL,然后用0.5mo1/L的稀硫酸调节溶液的pH值至7.0,用水定容至1000m.13.7淋洗液：甲醇卡水（1+19)。13.8样品定容液：甲浮+水(1+9)。13.94-甲基氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-甲溉氮基安替比林和4-基安替比林标准物质：纯度299%。
13.10内标标准物质：4-异芮基氟基安替比桥，纯度299%。13.11标准销备溶液：100mg/L。准确称取适的各种安乃近代谢物标准物质（13.9).用甲醇（13.1)配制成浓度为100mg/L的标准借备溶液，避光-18C保存，可使用3个月。5
GB/20747--2006
13.12混合标准储备溶液：1.0mg/L。吸取每种适量标准储备溶液（13.11)，用中醇稀释成1.0mg/L的溉合标瘤作溶液，避光一18℃保存，可使用1个月。13.13内标储备溶液：确称取适虚的内标标准物质(13.10)用甲醇(13.1)配制成浓度为100 mg/L标推端备溶液，避兆一18℃保荐，亩使用3个月。13.14内标工作溶液：0.20mg/L。吸取适量的内标储备溶液（13.13），用甲醇释成0.20mg/mL的内标标准工作溶液，避光…18它保存，可使用1个尺。13.15基质混合标推工作溶液：吸取适量的混合标泄储备溶液（13.12)和适整内标工作溶液（13.14)，用室白样品提取液配成浓度为1.0 /1.5.0 /L、10.0/L,20.0 μg/I.、40,0/L和内标浓度为0.20mg/1.的裁质貔合标推工作溶液。当关配制。13.16BomdElulCl固相萃敢柱或相当者：500mg，3mL。用前分别用5mL甲醇和5mL水处理、保持柱体漩润。
13.17滋膜：0.45um
13.18玻璃滤纸。
14仪器和设备
液情色踏-富联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)14.2胤相萃取装暨
鐵气教缩：
熊混勾器。
分析天平：感整0.1mg和0.01g。14.6
真空察。
14.7均质器：
移液器：10~100租100000。
繁丙烯离心管:50 mL,具塞。
14.10pH计：诞量循度土0.02。
抵温离心机：可冷到4℃
玻璃离心管:15 ml.a
试样的制裔与保存
15.1试样的制备
圾有代表性的牛或猪肌肉组织，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。
15.2试样保存
制备好的试样置于一18℃冰柜中避光保行。16测定步骤
16.1提取
称取 5 g试样,糖确至 0. 01 名。将上述样品置于 50 mL聚芮烯离心管(14. 9)中,加人 0. 25 mL 锨度为2.0mg/L的内标工作溶液（13.14)，然后加人15mL硫酸销十亚硫酸钠提取液（13.6)，均质1min，在10℃以4000r/min离心5min。将上清液转移到另一个于净的50mL容墅瓶中，残湾再分别加人15ml、10L硫酸钠+亚硫酸钠提取溶液提取两次，离心后，合并上消激，并用硫酸钠十亚硫酸钠提取溶滋定容至50 mI，混合均勾，然后用玻璃滤纸过撼，待得化，6
16.2净化
GB/T 20747—2006
取25mL提取液（16.1)放入Cla固相萃取社（13.16）中，以约1ml/min的流逆使举液通过断相萃取柱，待祥液全部通过后，依次用5mL水和5mL甲尊十水淋洗液（13.7)淋洗周相获取柱，弃去金部流出液，诚压抽平固格萃取柱10min。最后用5mL甲醇洗脱，洗脱较收菜于15mL玻璃离心管中：叠于氮气浓缩仪（14.3）上在55℃吹至近下，用样品定容液（13.8）定容至1.0ml。定容液癌勾后，过0.45上m滤膜，供液相色谱-审联质谱测定。同时取阴性样品，按16.1和16.2步骤制备空白样品提取液，用于配制基质混合标准工作溶液。16.3平行试验
按以上步骤，对商一试样进行平行试验测定。16.4回收率试验
吸取适量混合标准循备溶液和内标标推工作溶液，涨加到阴性样品中，按上述操作步骤，测定后计算样品涨灿的回收率。
16.5测定
液租色条件
色谱柱：AtlantisdCja色谱柱，3μm+150mnx2.mn或相当者：温：30℃.：
进样壁：30 ±L
抗动相、流速及梯度洗脱条件见表3表 3 流动相流遵及榄度洗脱紊件时间/min
质谱祭件
流速/(ml/min)
离子滇：电唢等离子源；免费标准下载网bzxz
扫描方式：正离子扫描
检方式：多反应监测（MRM)；
电喷器电压：5000V；
输助气流速：7.0L/min
辅助气源度：450℃：
聚焦电压：200V
碰磁室出口电压：15 V:
5mmol/.NHAc游液pH4.5/(%）
定性离子对、定量离子对、碰撞气能凝及会炭电压见表4。装4安乃近代谢物测定的质谐参嫩代谢物名称
4-甲氨基安替比称
定性离于予对(m/)
282/104
232/83
定属离子对(m/)
232/104
砸控气能摄/V
乙晴/死)
去候电压/V
GB/T20747-2006
找谢物名称
氨基发督比市
4-甲基氨安替比林
4-乙氨基安替比林
1-异芮氨
基安替比林(内标)
定些研于对(n/)
204/门59
204/111
218/56
218/97
246/228
246/104
216/56
246125
16.5.3液相色谱-串联质噗
16.5.3.1定性测定
每种被测纽分选择离纤离了，2
偿留时间之比，出就是翻对保留时间之内·且样品中各组套震杜离子的相相对中度进行比较暑愉整不超过表5
相对离子年度
允许的最大偏差
16.5.3.2定量测起
在仪器最佳工作条他下，对萃质度为横坐标绘制标准壁维山线：用标器测定的线性范用面种安乃近有4-甲酰氮基安盐比林和
筑基室
乘用内标法进行定整。
16.6平行试验
密乃近稳
表4（续）
定量离于对(m/≥)
218/56
2467228
，前尚笋
对离子丰度
溶波进祥
钱对样品进
按以上步骤，对同试样设行平行试验测定。避盗气能盗/
麦簇电压V
件下，耀品中特测物质和内标物的虑的相对保留耐间偏差在上2.5%证工作落液中对应的定性离子的存在对应留待测物。
10-2℃
为纵坐标，基质混合工作溶液浓容液中待测物的响应值均应在仪空测(MRM)色蹭图参见图B.1
基安都比袜新4-氮翡安替比林
的试验数据参见萨录D。
16.7回收率试验
吸取适墨混合标准工作溶液制内标标准工作落液月空向基质落液静释成所资浓魔的标准工作液。阴性样品中添加标准溶液，按62操作，测定后针算样品添加的收率。17结果计篇
4-甲酰氨湛安替比林和4·乙氨基安替比林结果按式（3)计算：×100
式中：
试样中被测组分留：单位为微克每千克（u/kg）：从标准工作非线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每寇升（/m工）；V..样品溶液最终定容依积，单位为毫升(mL);—样品溶薇所代裴量终试栏的质量、单位为克g)。8
4-母基氨基安替比林和4-氨基安替比林结巢接式（4)计算：A××Ax
试样中被测物残留量，单位为微克每下克（g/kg)：:1000
c.—--脂质标糖.J-作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每肇升(ng/mL)；A-
一试样溶液中被翘物的色谱峰面积A基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面程。c-.-试样溶液中内标物的浓度，单为纳克每毫升（ng/rCai
基质标准工作溶中内探物的浓度，单位为纳克每堂升（（mL)；一基质标准工作落液救内标物的起谱嗪面积；A试样溶液中内标榜的谱峰面积
一样液晟终定容桥理
验为毫升(mL);
m--一-试样溶液所代表给择的质鼠动享（g）注：计算结果底扣除壹白商
18精密度
本部分的精密度数据是按照G
以95%的可信度表逆
18.1蓝复性
在重复性条伴获得的两次
复性程见表6.
化合物名稀公助
4羊酸氨燕安势
4甲基斌基安荐
4Z.基安陵比梯
可鞋氮基安背比
4-氨基安比林
4-基安比
4-乙酰氮甚安背比林
新GB:T
试结某的绝对整
两发性
GB/F 20747--2006
（4）
数定确定的，堡性和再现性的值复性眼「,被测物的含范固及重
草现性隐R
1g-0, 757 5 Igm--0, S56 7
B7-0.866 0 Igm ~ 1. 050 2
Igr业 757 8 Igin- 1. 029
Igr-0, 607 6 Igm*-0. 801 9
Igr=0.7203lgn—0.955g
d b8744lge1. 115 0
5. 0-.4020m
5.0-~10. 0
注：邓为两次测庭结果的算术平均值。1gr=0.878 0 lgn-lg5962
T80F68677IR-0. 047 8
Igr-4. 007 8 Ig7n --1. 263 8Irt 0. 707 3 lgm--1. 002 7
tgr 0. 752 7 lgm —0. 077 91g7- 0. 756 7 Im-0. 884 7
Igr=1.122 7lgm—1.3928
Igr=0. 972 0 Ig3m—1. 260 0
如累差值超过熏复性限，应舍弃试验结果并重新究成两次单个试验的测定。18.2再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的含量范围及再现性方程见麦 6.
GB/T20747--2006
（资料胜附录）
三种安乃近代谢物标准物质及内标物的液相色谱图三种安乃近代谢物标难物质及内标物的液相色谱图，见图A.1。DAD1E.5ig-265.8Rtf-960.BO (DIP-0702/DIP-PK35.D)Norm.
14-甲氨基姿替比杯,1.6！sint
24摄基安替比韩13.60min
8—4甲基基安替比称，14.76 mi;4-异丙氮基安替比称（内标）,17.55inin。8
图A.1三种安乃近代谢物标准物质及内标物的液相色密10
附录B
（烫料性录）
四种安乃近标准物质及内标物的多反应监测（MRM)色讼图四种安乃近标准物质及内标物的多反应监测(MRM)色谱图，见图B.1。10ppb-23z,0/104,0(Unkunown)z3z.0/104.0anu-sample3oE44fram dip-20060705..Area:5, 92e-004 counts Height:4, 94c-00s cps RI:6.27min6. 27
10ppb-246. 0/I 4, 0 (Unknoum) 246. D/104. 0 amu-satmple 3 of 44 fron) cip-20060705.wifAuca:4. 39c-tc04 counts Heigi1t:6. 55c+U03 cjs RT:6, 2lmin2
10jji-204. 0/150, 0(Unluritwm) 202. 0/155, 0 umu-sample 3 of 44 from dip-20050705.iflAren:4. 43t:+004 cumls Hwight:. 60: +003 eps RT:7.73minaa
10pph)-21R. I/an. 0(Unknown)218. 0jf6. 0 Anu-sunpl: 3 ot 44 [rum dip-20060705.wiffAreir:5. 73e+-004 couuts Heiglt:1. 16e -+nn4 cps RF:7, 93min7.93
1. 00 e4
1Dppb-246. 0/125. 0(Unknowo) 246. D/125. 0 amu-sainpe ot #4 frsim: lip-20060705.nifArea:J, 04c+C04 rounts Heiglit:1. 62c+ U04 cps Rl:9, 06min)d
4-甲酰氯基安替比林，6.27 min2--乙氮基安替比林,6.21 min;
3-4-氮泄安替比林，7.78in
-4-甲基氨基安替比林,7. 03min55
4-异离氨垫安督比林(内标)5.06 min。电
GB/T 20747--2006
四种安乃近标准物质及内标物的多反应监测（MRIM)色谐图阁B.1
G8/20747-2006
附录C
（资料性）
回收率(液相色谱法)
猪肉唯安乃近代谢物的添加浓度及其苹均回收率，见C.1。衰C.1猪肉中安乃近代谢物的添加浓度及其乎均回收率（n-10)安乃近代谢物名称
4-甲酰筑范安替比林
4-慧安普料
4甲基筑基密替批机
美摄物的添加
牛肉中安刀
*.2牛肉厅
安乃近化谢物奢称
4-中酷氨基安
4-氨提安替比林
4~净基筑基安替比
港加/（u区/kg）
光均收
加浓度！
廊收率/（）
南回收率（10）
敢（）
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