【国家标准(GB)】 牛、猪的肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T20746-2006
牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Method for the delermination nf the residues of carbadux, ulaquindox andrclated metabolites in hovinc and porcine livcr and muscle tissues-LC-MS-MS mcthod
2006-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数防伪
中国国家标准化管理委员会
2007-03-01实施
本标准的谢录 A和附求 B为资料性:附录。标准山中华人民共和国案垒岛出人境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国压家质量监督检验检疫总局归口。GB/T20746—2006
本标准起草单位华人民共和国案皇岛出人境检验检疫局，中华人民共和国深圳出人境检验检疫。
本标准上要起草人：宠国芳、谢丽琪、欧阳、蓝芳、林黎、涂小珂。本标准系首次发布的国家标准。1范围
牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T 20746—2006
本标推规定了牛猪吓脏和肌肉中卡巴氢及其代谢物脱氨卡凹氮、喹哦啉-2-羧酸和乙醇代谢物3-甲基喹喂晰-2-羧酸残留量的波相色谱串联质谱测定方法，本标准适用丁牛，猪肝脏和肌肉中下巴氧其代谢物脱氧下巴氧、喹啉-2-羧酸和哗乙醇代谢物3-甲基唑唾啉-2-羧酸残留量的定本标推的力法检出限：卡巴脱氧卡巴组、喹嗯啉2般酸和3-甲基喹嘎-2-羧酸均为0.5g/kg：2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不证日期的引用文件,其最新版木适用于本标GB/T6379. 1测量方法与结果的准确度（止确度与精密度）第 1 部分：总则与定义(GB/T 6379.1-2004,ISO 5725-1:1994,HDT)GB/T 6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法再复性与再现性的基本方法(GB/T6379,2—2004.ISO5725-2:1991,IDT)G3T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，nen1S）3696：1987）3原理
用之十乙酸乙酷(1十1)溶液提取肌闪和肝脏组织中的卡巴氧，提取液经正已炕脱脂后，旋转蒸发至下,残渣甲酸(0,1%)+甲醇(19十1)溶液溶解，样液供相色谱-串联质谱仪测定.内标法定量，用甲酸溶液消化试样：使组织中天然存在的酶失活，然后卵人强白酶水解：盐酸酸化，离心过滤后：过Oisis MAX固相率取柱或相当者净化：先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧,再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脱连啉·2-发酸和3 甲基唑噗 2-酸酸,氮气吹干洗脱液，残渣川中较一甲醇(19一1)溶液溶解,样液供液相色谱串联质谱仪测定，内标法定量4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯+水为（GB/T 6682舰定的一级水。4.1中酵：色谱纯.
4.2乙睛：色谱纯
4.3甲酸：色谱纯。
4. 4 正凹烷、
4.5乙酸
4.6浓盐酸，
4.7乙酸钠
GB/T20746—2006
4.8_甲苯甲酰。
4.9乙酸乙酷
4.10中性载化智：200月~-30%日，4. 11乙鞘乙酸乙酷溶液(11)。
4.12中酸乙酸乙酯溶液：2%，向400TILL乙酸乙能中加入10ml甲酸，用乙胶乙酯定容至600mL4. 13 甲酸溶液:0, 6 量取t. 0 m1. 甲酸,用水落解、定容至 1 1.。4.14甲酸游液：0.1%。最坡1.0ml.中酸，用水溶解、定容至11.。4.15甲酸+甲醇溶液（19—7）：用100ml，甲酸游液（4.14）与10ml.中醇（4.1)混合，盐酸溶液:0,1 mal/l最圾 8.3 ml浓站酸,用水溶解、定至1L，4.16
盐酸溶液:0. 3 T1/L。量取 25 IL 浓盐酸,用水溶解、定容至 1 [.4.17
4.18['retcac蛋户嗨:SigmaP5147或相当者，-18:以下保存。4.19蛋凹酶水辫液：0.01g/ml，称取1.00gPratcasc蛋白(1.18）.用水溶解、定容至100mL,4℃保存。
4.20乙殿溶波:10烂，量取100 tml.甲酸,用水溶解,定穿率1L4. 21 乙酸钠溶波;0,05 mal/[.,pH =7。称收 6.8 g 乙酸钠用 800 ml.水溶解,再滴加 10乙酸浒液以调节落波PI7，用水霆穿至1L：4.22乙酸钠1中醇浴液（19+1），J川)J90ml.乙酸销溶波（4,21）与10ml甲醇（4.1）混合。4.23甲醇水溶液(1+1),
4.24Tris 碱:Sigma T1503或相当若。4. 25 Tri溶液:1. 0 rno1/L。称 121 g Tris 喊,用水游解、定容至1 I,4℃保存。4.26卡巴氢、脱氨卡巴氧，唑喂嘛2羧酸、3中基噬唔啉2羧酸、噻嘴啉2-羧酸4标准物质：纯度99
4.27标准储备济滋：100mg/L，准确称玻适鼠标准物质，卡巴氧用一甲基用酷胺溶解定容，其余标准物质分别用中醇渐解定穿，忆成10g/I.的标准储备液，在：8亡保存，可使用1年，4.28基质混合标准工作浴液：根据灵敏度和使用需要，用空凹样品提取配成不同浓度（g/1.）的基质混合标准工作溶滤，在4C:保存，可使用1周4.29内标工作溶液：准确取适基内标标准物质，用中醇游解定穿，配成1001严/I.的标难.L作溶液在1“保存,川使州1周。
4. 30离子交换非Juisis MAX 60 r1g·3 ml或相当者，[前分别用 3 nil.中醇和 ml.水活化,保持托体湿润：
4.31滤膜：0.2μm。
5俊器
5.1液和色谱-串联质谱议：配有电喷筹离子源。5.2固杆萃取装置：
5.3氨气浓缩仪，
5.4液件混勾器。
5.5分析半：感量0.10.01g
5.6真空泵。
5.7均质器。
5.B移被器：10ul.-100μl.和100μl1000μl.。2
5.9聚内烯离心管53ml..具塞
5. 10pH计:测质精度_0. 02 pH 单位。5.11低温离心机：可制冷到4。
5. 12戒离染心管:15 m1.c此内容来自标准下载网
6试样制备与保存
6.1试样的制备
GB/T 20746—2006
将牛、猪汗些和肌肉组织样品充分搅碎,均质、分出(.5k作为试样，置于清沾样品容器中、牵封，并做标记：
6.2试样的保存
将制备好的试样于「8以下探存。7测定步骤
7.1卡巴氧的前处理步骤
7.11称圾试，精确举0,1。置于ml策两烯矫离心誓,加人5g中性氧化铅（.10）7. 1,2 人25 ml.乙晴一乙酸乙溶(4. 11).于液体混匀器上充分混合 5 min.以$ C r/min 离心5 mit!,将上洁被移退至一「将的 50 ml.离心管，川人10 ml.正己烷l！1)到管内，振荡 2 min.以5 0iin离心min.牟上层已.将下层清液转移至_心 ml鸡心顺中，7.1.3重复7. 1.？出骤·欲：合并两次提取没于问·-鸡心瓶中,加人：-定量的喹唾啦-2-羧殷(14标游溶液（4.29},使H浓度为2.）ng-水浴,减压施转蒸发至17. 1. 4准确加人1. 5 11l 酸一中辟溶液(4. 15)溶解残,过0. 2 m滤膜后,供液扣色谱中联质谱被洲述
7.2脱氧卡巴氧喹嗯啉-2-羧酸,3-甲基唑啉-2-羧酸的前处理步骤7.2.1移收5g试样，销前至00！，置下50ml.聚丙烯离心管中，川人10mL0.6中酸济池(1.[3)混后,胃于(17+3):振荡水浴中振源 1卜;光加人3 ml.1. 0 mol/1 T-i游液(4. 23)混]]再加人 0.3 t1:L蛋占酶水溶液（.19)充分混与后置于(47±3)振荡水浴中酶辩i6 h~18h。加人2l :1. 0. 3 mo!/[, 腰溶液(4. 17),振荡 5 min,在 10℃:以 5 00l r/min 离心15 1nir,[清液过滤,7.2.2两滤滁（7.2.1)移人（)asis MAX 固相萃疫柱(1,30)中，待样液全部流出.用 3℃ ml.乙酸钠中学波（4.22）淋洗固获取杜.真空抽下15m7.2. 3在支干净的玻璃管内加人一定量的唾啉-2-羧峻-d标雅济滋（1.).使其浓度为2. n/g冉用13 mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧淡脱卒内在45℃用组气浓缅仪吹于。7. 2. 4 同相萃吸柱抑川 3×3 ml H醇,3 ml. 水、B×3 ml. 0. [ mal/L 盐酸落液(1. 16)和 2×3 ml. 甲醇一水济波液（4.23)分别淋沈·真空抽十15ci:1,然后用2 TnI.乙酸乙酯淋洗固相荤敢析，年小个部淋出滴,最后用 3 n\iL,甲酸乙酸乙循溶液(4. 12)洗脱唑恶咪 ？发酸和 3-甲基峰姚啉-2-羧酸刘 7. 2. 3所片试管中仆州氧{浓缩仪吹下雅确人1.m0.「巾酸一甲帮溶液（，)熔解残渣，过2um滤膜供液色谱中联质谱仪测定：7. 3色谱测定
7.3.1液相色谱条件
色说托:lnerts01s，3μm，10 m×2.1 m(内径州者:）
b）流动机：中醇乙晴以没%中胶游波，碎度洗脱系件见表1：e)速:0,ml/min：
GB/T20746—2006
柱温：30℃
进样量：30μ
时间/min
质谱条件
表 1梯度洗脱条件
甲醇《）
离子源;电唢雾离子源；
扫描方式：正离了扫描：
捡测方式:多反应监测;
分辨率：单位分辩率：
电喷雾电压：5000V，
蒋化气流速：8.01./nin:
气帘气流速:7. 0 1./min F
捕助气流速，5.[./min
离子源温度：450%
定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2乙（）
「甲能岭
表 2各种化合物的定性商子对,定量离于对、去簇电压、碰撞电压、碰撞池出口电压定性离子对
化合物名款
卡巴氧
坚-2-
脱氧卡巴氧
3 甲基喹啮啦-2 羧酸
253.2/90.1
263. 2/231.1
175.0/129,2
175.0/131.2
231. 2/143. 2
231.2/9u.2
189.2/1431
189. 2/145. 1
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性测定
定最商了对
263.2/231.1
17t.0/131.2
231.2/113.2
189.2/145, 1
定基内标
离于刘
179.2/133.2
179. 2/153. 2
179, 2/133, 2
179, 2/13. 2
去燃电正案焦电压心境电压，
硅撞泄出
口电压！
每种被测组分选择］个母离了,2个以上子离子,在相间试验条件下，样品中得测物质的保留吋间，与混合标准工作熔液中对应的保留时间偏差在二2.5%之内各分析化合物的参考保留时间见表3:样品中各组分定性离了的相对十度与浓度接近的混台标准工作溶液中对应的定性离了的相对度进行比较，我偏差不超过表4规能的范用，则可判定为样品小存在对应的待测物。化合物名称
保留时问/mit
担对离子「度
允许的最人偏总
7.4.2定量测定
卡巴氧
表 3 各分析化合物参考保留时间唑堪2羧酸
脱氧卡巴氧
表 4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 50
*20--50
10-·20
(/T20746—2006
3-亚基噻逐琳-2-酸酸
用混合标准工作率液(4.25)分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作山线，用标准工作曲线对样品进行定量样品溶液卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹呕啉-2-羧酸,3-用基喹感啉-2-羧酸的响成值均在仪器测定的绒性范国内。卡巴氧、脱氧卡巴氧、唑唾琳-2-羧酸、3-甲基哗呕啉-2-羧酸的标准总离于流图见图A。1。7.5平行试验
按以1步骤,对同-试样进行平行试验测定。7.6回收率试验
阴性样品中添加标准溶液,按步骤7.1～7,4操作.测定后计算样品添加的回收率，8结果计算
试样中每种化合物残留鼠利数据处理系统计算或按式(1)计算，计算结果应扭除空白值：x=x
式中：
试样被测物残留星，单位为微克每克(ur.kg)；c
基质标准工作溶液中钣测物的浓度，单位为纳克毒毫升（ng/mL)：-试样溶液被测物的色谱峰面只；A,—
基质标准「作溶澈中被测物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每笔升（ngml)；基质标准I.作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)：基质标准下作溶波中内标物的色谐峰而积；A..
试样溶波中内标物的色谱峰面积：样液最终定容体积,单位为毫升（mL)：试样溶被所代表试样的质量：单位为克（g）。注;计算结果应抑除咨户值。
9精密度
本标谁的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6370.2的规定确定的，单复性和再现的值以95炎的可信度米计算。
9. 1 重复性
在毛复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再复性限产,组织中四种分析化合物的含量范国改重复作力程见表，。5
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化台物名称
脱卡巴氧
咪-2菜酸
3日基唑些味2差校
含量范围及重复性和再现性方程含显范围：
tpg'kgi
G. 3 -- . 5
0. --. 4
n. l:--5. t
0. 5 ~5. 0
注：州为两次测光结只的算术平均信质
重笈性腺
-R r-c. 844 0 lg 2-1.022
0. 833 x I w- 5. 82: S
1g r- U. 51a ti lg m
. 5i9
Ig r-0. 884 0 -u m - 0. 413
Ig r-1. 171 5 1y m-6, 70
-3. 831 6 1g m-0, 914 8
再现性限R
Ig R --0. 788 t l 1 --0. 8393Ig R-0. 794 : lr m -0. 814
1x R=0. 578 1 Ig m-0. 735 6
Ig R=C.712u-0.78: 2
1g R-0.910 5 n-0. 826 3
0. 74: 5 I n* 0.778 2
Ig R-t,776 0 l m 0.72: 2
Ik R-0. 73. 5 6 m0. 723 8
如架差位超过重复性限，应含试验结果并亚新常成哟次单个试验的测定，9.2再现性
在现性条件下，获得的两次然立测试结果的绝对差估不超过再现性限组织小旧种分析化个物的含量范剧及而现性方程见表。8, 024 1
卡巴氧.9. L1 irin;
2—~唑哒啡 2-羧酸,9, mi:
—3甲基唑瞬味 2-羧酸,10. 97 1i1;4—脱卡巴氢,11. 43。
附录A
（资料性附录）
标准物质总商子流图
图 A, 1标准样品总离子流图
GB/T 20746—2006
.18.42
GB/T 20746—2006
附录B
（资料性附录）
回收率
本方法中下巴氧、脱氧卡巴低、座啉2-载酸、3-甲基哮唔嘛2废在四种基质中的添加浓度及其半均回收率的试验数据，见表13.1。表B.1四种目标化合物添加浓度及其平均回收率的试验数据药物名称
脱朝卡巴丸
喹呕啦-2-羧
3-甲基唑啮咪 2 羧酸
涨加浓度pg/kg>
GB/T 20746-2006
平均四收治)
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5号:155065 - 1-28032
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