【国家标准(GB)】 牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

1范圈
GB/T 20758--2006
牛肝和牛肉中辜酮、表睾酮、学酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法
本标准规定了牛肝和牛肉中率酗、类率酮和孕残留蟹的羧色谱-朕质谱测凝方法。本标准适用于牛肝和牛肉中聚酮、表睾酮、孕期残留量的测定。本标谁的方法检出限：肝贼节睾酮、素率蹦、学霸为 0.5 ，肌肉睾酮、表率嗣为0.1 μg/kg，孕为 0.5 μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中条款通过求标谁的引修改单（不包括勘误的或修订
可使用这些文件够题版本，凡
GB/T6379.1测端方法与绩
(GB3/T 6379. 1-20ASO 5725-1.GB/T6379.2量方法与结
性与再现性的基
GB/T 6682
3原理
牛肝和牛肉汁
萃取杜净化，肝样
试剂和树料
晨GB/T6379
塞用水
装酮、
睡经硅校
瀚度（正确膜
b04,1SO 5725-2.199
除另有说明外，所用旗剂数分祈缆：水为GB/T6682规定的一4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3叔丁基胃醚：色谱纯。
4.4正已烷：色谱纯。
4. 5 三氮中烷。
4.6甲酸铵。
4.7β-葡糖苷酸酶和硫酸醋，H-2型,helixpomatia。归潮引用件，淇随后所有的
据本标滤达成协议的各方研究是适用于春标痛www.bzxz.net
第部餐：总则与定义
2部分：确定标准测超方法重复
,teq s0 3696:9s7)
基甲醚瑕：敢液片C固相
，供液相色谱-事联质谱测定。
4.8磷酸盐缓冲液：1.0mo1/1.。称取13.6g磷酸二氮钾溶于100mL水中，称取8.7g磷酸氢二钾溶于50mL水中，分别取70mL避酸二氢钾水溶液和28mL磷酸氢二翊水溶液，混勾后调节pH值为5. 0,置1℃中可保存 1 周。
4.9饱和氰化钠水溶液。
4.10水炮和乙龄乙酷。
4.11离酮表睾酮、孕酮标准物质：纯≥99%;东代睾酶(d-睾酮）,氛代孕鹤(d-孕酮)内标标准物质；纯度≥98%。
G$/T 20758—2006
4.12标准储备溶波：100μg/mL。准确称取适置的睾丽、表数酮、孕酮标谁物质，用甲醇分别配制成100g/tmL的标准储备溶液：一18℃存，可使用6个月。4.13标工作溶没：5g/mL。分别吸取5ml率酮，表翠丽，孕酮标准借备漆液（4.12)至100mL容““整瓶中，以挥陈稀释并楚容此标谁工作游液的放度为S/证：-18延存，前使用8个厅。4. 14 合标推工作溶液:50 μg/L。分别吸取 1, 00 mL凝酮、表率酮、孕标准工作液(4. 13)至 100 mL容量瓶中，以甲醇稻并定容，此混合二工作溶液的浓度为50/L。一18℃贮存，可使用3个月：4.15内标储备溶液：100μg/mL。推确称取适的尔代睾酮（ds-酮）、氛代孕酮（dg-孕酮）标准品，用甲分别配制成100g/mL的内标储备溶液，一18℃存，可使用6个月。4.16内标工作溶液：5μg/mL。分别吸取5tm氛代睾（d,-睾酮）、氛代孕酮（d-孕丽>内标储备落液(4.15)至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。一18℃贮存，再使用6个月。4.17内标混合工作溶液：25宫/L。分别吸攻0.50mL氛代睾酮（d-睾翻）、氛代孕酮（dg-孕酮）内标工作溶液（4.16）至100mL.容量瓶中，以甲醇稀释并定容。一18℃贮存，可使用3个月4.18基质混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范圈，吸取定量的混合标准工作溶液（4.14)利内标工作溶液（4.16），用空白样品提取液配成系列液度的基质混合标准工作溶液。当天配制。
4.19C固柑茶取柱：500g，6mL。使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。4.20
硅胶固相萃取柱：200mg，6mL。使周前用6ml.正已烷活化。4.21
滤膜0.2从m。
5器和设备
5.1液相危谱-串联质谱仪：配有电喷露离子源。5.2分析天平，感盘0.1m和0.01%。5.3勾质机。
5.4高速组织勾浆机。
5.5低湿高遮离心机:转速大于 4 000 1/min。5.6高速离心机：转速大于12000r/minc5.7超尚波。
5.8旋泻振游器。
5.9振药水浴。
5. 10氮气浓综仪。
国相蔡取装膏。
旋转蒸发。
KD浓缩瓶。
6试样制备与保存
6.1试样的制备
取样品约500用组织据辞机摘碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。6.2试样的保存
将试样于一18℃保存。
7测定步骤
7.1酶解
推确称取5g试样，准确至0.01B，置于50mL离心管中，依次加入200μL内标混合工作溶液2
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（4.17）、10m1.磷酸盐级冲液（4.8)，以14000r/min均质305,加人60uL葡萄苷酸和硫酸酯酶（4.7混勾305,斑于37℃恒漏振荡水浴中酶解16h7.2提取
静解后的祥品裕拨（7i)加10m甲馨，约2min，麗你浴中放暨5min，在5℃以4000r/nin离心10min，上清液转移至50mL离心誉中，下层沉淀再用5mL甲醇章复上述操作一次，合并上消液至上述50mL离心管中，尚离心管中加人15mE叔丁基甲醛，振5min，以4000r/min离心5min，上层溶液转移至125mL分液漏斗中，下层溶液依次再用15ml10mL敏丁基甲醛提取两次，合并上层溶液至上述分液漏斗中，加人10mL饱和筑化钠水溶液（4.9），振摇306，静置分层，上层溶液转移至形瓶中，在40C旋转蒸发下，残渣中加人1.5ml.甲醇，旋1min，超声5min，再加入20mL水，混匀，待净化。
7.3净化
将样品提取液（7.2)转移至已活化的C固相萃取柱（4.19）上，用5mL水洗涤梨形瓶，洗涤液合并至Ci固相辈取柱中，以≤2mL/min流速使样液通过周相萃敢柱，待样波过柱后，用5ml水淋洗Ci固相举取桂，奔去淋淡液，用10mI，甲醇将待测组分从C.固相萃取柱上洗脱，洗脱液转移至裂形瓶中，在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mnL甲醇溶辉残渣，涡旋1min，加入0.5mL水混匀，过0.21m滤膜，供液相色谱-常联质谱测定。肝脏样品的洗脱液蒸干店，间裂形瓶守加人0.5mL三甲烷，锅熊1mix，加人5mL正已烷，超南1min，然后转移案巴活化的硅胶周相萃取（4.20)巾，以1mL/mia流速使祥没通过固相萃取桂，待洋液过柱后：用5mL正己烷淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋洗液.用6ml.小他和乙酸乙脂（4.10）洗脱待测组分，洗脱波转移至KD接收瓶中，在40C旋转蒸发至于，加0.5nL甲醇.祸旋1min，班入0.5naL水视匀，过0.2μIm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。称取阴性样品，按7.1、7.2和7.3步骤制条空自样品提取液，用子配制系列基质饿合标滤工作溶液。
7.4測定
7.4.1液相色谱条件
色谱柱：C色谱柱，5um，150mm×2.1mm（内径）：a）
柱湿：40℃；
样量：20uL：
流动相、流速及梯度洗脱条件见表1.表1流动相、流邀及梯度洗脱条件前间/min
质谱条件
流速/(mL/min)
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描：
检測方式：多反应监测；
艺/(光)
3 rninal/L 甲酸铰/(%)
化气、气帘气、辅助加热气，碰控气均为高纯氮气及淇他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵橄度达到检测要求，3
GB/20758--2006
e）喷筹电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度：f）定性离子对、定盘离可对、去簇电压和碰撞能整表2。表2睾酮、表睾酮和孕酮及内标物的质谱参效被测物名称
筑代密酮
(翠）
筑代孕萄
定性商子对
289797
289/109
289/97
289/105
315/109
315/97
3您辉00
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
每种被测组分选
与标罹溶液中对应命
标准溶液中对应的
在对应的待谢物。
相对离于丰度
允许的嵌大偏装
7.4.3.2定盘测定
这址离争对
(m/）
289797
294/1g
个母离子
时闲偏差
离子的相对半
定孕用内标物
屹代睾酮
筑代率酸
筑代孕酮
采时间/ms
去筷克压/V
避抢能运/V
下，样品中测物版的保留时间
生离子的相戏半度与浓度接近的定的范围，购可判症为样品中存校，昔偏差不超过
表3定忆确相对高度的量
-20-~50
美新推游液小被测组分峰面积和内在仪器最佳工作条你下基质灌综准工18进租
标物峰面科的比值为织坐标标润溶液中被测组分依度与内标物浓度的比遵为横垂标绘制标痛工作曲空遵样品溶液中待测物的响应值均应变夜器测凝的线性范国内，内标线，用标推工作做线对样品行
法定量。率间、表酮和孕综催物质的反应监测（MRM)色谱渗见图1和图A.2.睾南、表睾酮和孕酮的添加浓度及其平均回收密的试骏数据原泰7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行第行试验测楚7. 6 回收率试验
阴性样晶中添加标准落报，按7.1～7.3操作，测定后计算样品添加的阅收率。8结果计算和表述
结果按武(1)计算：
武中：
会×%×
试样中被测物残留量，单位为微克每千克（ug/kg)；1000
...(1)
基质标演工作溶滋中被测物的液度，单位为纳克每升（/mL）；c
试样溶液中被测物的色诺峰面积；基质标准工作溶中被测物的色谱峰面积；试样溶中内综物的浓度，单位为克每管（/mCai
基质标谁工作溶被中内标物的液度、单位为纳克每升（/m)基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A-—试样溶凝中内标物的色谱峰面积；V栏液最终定容体积,单位为套升mL)2
9精密度
试祥溶液所代表试样的质最，单位为克（g）。GB/T 20758--2006
本标谁的精密度数据是照G13/T5%6379.2的定确定的，重复性和再现性的值以95%的可倍度来计算
9.1复性
在要复性条件下
复性方程见装4和囊
俩款独金
爱含量范典
化合物名你
注：州为商
化合物名称
结原的就术
含性范
注：为两次谢延缩量
试给乐的绝对荐
真不超过重复性限：
：被谢物的含范围及重
基溃为肉）
问现性限R
R= 0.973 0 m 0. 026 8
-0. 01 0 m-0. 016 8
-0.218 m+0. 017 8
基质为肝脏
游现能限R
c9153 m 0. 000 8
,133 0. 033 1
R-0.032 6 m+0,057 7
应舍弃嵌验结果将董新完戒两次单个诚验的测楚如果差值超过重发性頭
9.2再现性
在再现性条件下，得能阅饮症盗趣试结果的绝对差语不超过再聪性限R，被测物的含望范用及现性方程贴裴4和表5。
GB/T20758--2006
附录A
（资羿性附录）
睾、衰率丽和孕酮的多反应监测(MRM)色谱图孕期标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A.1。10.7
20/min
照A.1孕酮标准物质的多反应监测(MRM)负谱图4.2宝照、表整酮标携物质的多反股监测（MRM)色谱图，见图A.27995
8.9柴资险
睾酮、裘睾酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图图A2
附录B
（瓷料性附）
回收率
睾酮,表睾酮和孕酮的添旭浓度及其平均回收率的试验据，见裘B,1GB/T20758-2006
表 B. 1 睾酮、衰睾酮和学阐的添加浓度及其平均回收率的试验数据(u= 10)样品基质
化合物名称
添加水平/(μg/kg)
平回收%）
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