【国家标准(GB)】 牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留的测定 液相色谱-串联质谱法

1范萄
GB/T 20761--2006
牛中0-群勃龙，群勃龙，19-乙烯宏甲辜酮和--艺烯芸年馨酮残留鑫的测定
液相色谱-串联质谱法
本标谁规定了牛尿中α-群勃地、3-群勃龙、J9-乙烯去甲案和epi-19-乙燃去甲率潮残留做的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标适用于牛嵌中α-群勃龙、β-群勃龙，19-乙烯去甲罩酮和cpi-19-乙烯去中睾残留龙的测定本标准的方法检出限：牛尿中a-群勃龙、B-群勃论、19-乙烯去甲睾谢和epi-19-乙稀去中翠响均为2 μg/L
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标谁的引用而成为本标准的条款。儿是注日期的弓用文件，其随后所有的修改单（不包活勘误的内容）或修订版均不适用于本标准·然而，鼓励根据亦标准达成协设的各方研究是否可使用这些文件的做版本。凡是不注期的引用文件，其最新版本适用于本标温。G3/T6879.1测氧方法与结果的准确度（正确度与精出虚）第1部分：总则与定义(GR/T 6379.1--2004,ISO5725~1:1994,1DT)GB/T6379.2测量方法与结果的雅确度（股确度与精密度）第2部分：确定标准测图方法重复性与再现性的满本方法（G/T6379.2--2004，IS05725-2：1994，11T)GB/T6682分析实验案用水规格利试验方法（GB/T6682-992.neISO3656，1987）3原理
试样在pH5.0条件下加酶水解，经免疫察和柱化，用羧相色谱-串联债谱测定，外标法定适。4试剂和材将
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.水为G3/T6682规定的--级水，4.1平醇:色谱纯。
4.2乙腩，色谱纯。
4.3乙酸：色谱纯。
4.42-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸赠(9-glucuronidaseand arylsulfatase)：100000 unit/uL。4.5氧化钠溶波：1mol/L10g氯氧化钠溶于250ml.水中。4.6盐溶液：1mol/L。吸取20.8mL浓盐酸溶于水中，定容至250ml.4.7免渡亲和住潜洗缓冲借备液和柱贮存缓冲错备液：免疫亲和柱附带。4.8柱淋洗缓神溶液：量取11mL错备溶液与19mL水混溶，临用前现配。4.9柱贮存缓冲溶液：量取1ml储备溶液与4mL水混溶，临用前现配。4.10甲醇+水溶液：70+30。
4.11α-群勃龙、3-群勃龙、19-2烯去中酮和epi-19-乙烯去甲翠酮标推物质：纯度学98%4.12标准储备液：分别精确称取z-群勃龙、3-群勃龙、19-乙烯去中器酮和epi-19-乙矫去币翠酮标汇物质（4.11)各0.0100.用乙（4.2)溶解并定容至100mL，配制成100g/mL的标准借备溶液。此GB/I 20761—2006
一18℃冷冻保存，可使用六个月。4.13混合标准工作溶液：取标推储各溶液（4.12）备5mL暨于50mL穿量瓶中，用乙腾定容荃刻度配制成混合标准二作溶液，浓度为10μg/mL，此溶液一18℃冷冻保存，可使用三个月。414，链都，19艺烯去甲馨谢免疫亲和社滑育在选缓冲循香蹈液挂循荐发评谐备液，社2℃～8℃ 保存。
4. 150. 45 [2m滤膜。
5仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷翼离子源（ESI)。离心机：最大转速50001/五。
恒温水浴摇床。
旋祸合。
氮气浓缩仪。bzxZ.net
固独萃取装胃。
试样的制备与保存
试样的制裔
取新鲜牛尿迅迹冷冻作为试样
6.2试样保存
制备好的试样舞需-18℃冰框
7测定步骤
7.1基质混合标准校准溶液的制
7.1.1试样的称敢
5个阴性样磊将冷陈尿液剃
样品分别量取5m1.精确割0.01
(4.13),使各被测组分的衰度均为7. 1.2水解
分别将上述离心管落毅
r/min心1min。然唇，每个
别加人将同经混合标准工作落液 ng/mL,loQ ng/mL.
1 11o1/I. 的势酸(4. 6)调节尿样 pH 僵在 4. 9-5.1之间，接著加人
401β-储狗糖首醇和势然硫酸鼠（4.4），摇勾后尝好塞于置于柜温水浴播床（5.3)上37℃振水解2h。待水解液冷部至宝温后，加人m杜淋洗缓冲溶液<4.8)用1mol/氢氧化钠游液(4.5)调整尿样 PH 值在 7--9 之间。
7.1.3免疫亲和柱净化
首先将桂贮存缓冲溶被（4.9)过柱，再用15柱添既缓冲溶液平衡柱子。然后，将水解处班好的尿样过柱，接着依次用8mL柱淋洗缀冲溶液、5ml水淋洗柱子。最后，用4mL甲尊十水溶液（4.10）洗脱分析物并收集于带刻度的试管中（上述过醒过狂流速应≤2mL/min）。洗脱液用氮气浓箱仪（5.5）在60℃水浴中欣至约1mL，用流动相定率2mL，旋涡振荡（5.4)混合，过0.45um滤膜（4.15)供LC-MS-MS 测定。
注：为确保柱子在下次使用时光戏留影响，应密续用10mL甲融十水落液（70一30)洗涤柱子。若接着使用此柱，则重复7.1.3步。若不再使用，应用15mL柱贮在级冲溶液洗涨检于，最后杜内保南5mL柱贮存级冲溶液2℃一8℃保存。此核能重复接用10秋左右7.2试样溶液的制备
将冷冻尿液样晶融化混勾，取部分样品以转速4000r/min离心10tmin。然后，氧取5mL（猜确到2
0. 01mL)于15 mL具塞离心管中。按7.1.2和7. 1.8操作7.3室白基质溶液的制备
GB/I 20761--2006
将阴性冷冻尿液样品避化混匀，玻部分样晶以转速4000t/nil离心10min。然后，望取5mL（糖确到0.01m于15真辫商心管：按7.2和73燥准。7.4测定
7.4.1液相色谱条件
色谱柱：lnertsilCi，5μm150mm×2.1加m《内径）或相当者；流动相：0.1%乙酸水溶液一乙膜(686)
流速：0.3mL/min;
色谱柱温度：35C
进样量：20μL
质谱紊件
离子源：ESI.退程
雾化喷嘴药锁
于煤气流.0/mini
干燥气温度送55℃
毛细管电压密能电压、碱
检测离于对购表1。
-群轨
10-乙娇法更琴聊
epi-9-艺娜
定盘商于。
7.4.3液根色谱-串联康谱测定
7.4.3.1定性测定
每种被测组分造择
敏度：
子离子
商了m/
海离子，2个以上子离子.在相同实验条件，样品中待测物质的保留时间，与法质混合标准校准溶液中减的保留时间偏差在士2.5%之内；是释品谱图市各组分定性离子的相对半腹与浓度接近的基质混合标灌校准溶滚谱图中对虚的怎性离子的机对半度避行比较，偏慈不超过裘2规的范围，则可判定为样品欧存在对荒的待测物表2定性确证时相对离子丰度的最实允许误差相对子丰度
允许的相对误馨
7.4.3.2定量测定
>10-~20
±- 30
在仪器最佳工作条件下，对基质混合标推校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，质混合校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作线，用标推工作曲线对样品进行定载，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标谁品选择离子质经色增圈参见图人，1本标维的添卵回收率数据参见陷录剪。本标准的添加回收举效据参见附录。7.5平行试验
按以上步骤，对-一试样进行平行试验测定。3
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7.6回收率试验
吸取适堡混合标泄工作溶波，用空白基质溶液（7.3)稀释成所露浓度的标翟校雅溶液。阴性祥品中添加标摧溶羧：按了7.2操作,测定后计算样品涨加的国收率。8
结果计算
试样卡被测组分残留盘利用效据处理系统计算或按式(1)计筹：X=cx
试样中被测组分残留盘，单位为微克每升（g/L）-从标准工作曲线褥到的被測组分溶液液度，单位为纳克每壁升（ng/mL)；VI一一样晶溶液最终定容体积,单位为笔升(mI);V.—样品溶液所代表最终试样的体积,单位为毫升(mL)。9精密度
本标准的精密度邀据是按照CR/T 6379. 1 和G3/T 6379.2 的规定确定的，重复性和再现性的以95%的可信度米让算。
9.1睾性
准重复性紊件下，我得的涡次独立测试结聚的绝对英值不翘过爱复性限被测物的合量范围及复性方程苑表8，
如果差值超过复性腿，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性
在再现性紊件下：狄得的两欲独立测试结果的丝对差使不超过再现性限R，被测物的含丝范用及再现性方程见表 3。
裘3四种分新物的含运范圈及显愛性和再现性方程诚谢物名称
B-辩勃论
心-群勃龙
19-去翠
cri-19-乙烯去华辈朗
食最范围/(1g/L)
2 -- 4C
法：为满软剃定结果的算茶均值，钜复性限？
Ig r*m0. 823 l m---0. 875
Ig r.0. 828 lg J --0. 820
g =0, 7:1 Ig m--0. 831
lg J=0. 708 g -0.716
再现性限良
Ig R= 0. 871 ig :-- , 546
e R=0. 863 2 m-0. 571
ig R=0. 438 g m--0, 606
Ig R= 0, 984 ig m— 0. 881
附录A
(资料性附录）
标准物质选择离子LC-MS-MS图
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α-群勃龙、β-祥勃龙、19-乙烯去甲器酮和epi-19-乙烯去甲紧酮标品的选择离于LC-MS-MS图，见图 A.1。
一3醉勃培：
一α：
3-19-乙烯去甲攀酮
4---epi-19-矫去甲丽
图A.1x-群勃龙、群勃龙、19-乙去甲酮和ei-19-乙烯去押标准品的选择离子LC-MS-MIS图附录B
【资料性附录
四种分析物的添相浓度及其平均回收率的设验数据，范表B1。联，1四种分析物的添加浓度及其平均回收率的试验数据（1=10）深加水/g/L)
β群勃龙
α-群勃龙
分析物的回收率/(%)
19-乙烯去手
eni-19-
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