【国家标准(GB)】 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法

ICS67.120
中华人民共和国国家标准
GB/T21318—2007
动物源食品中硝基咪唑残留量
检验方法
Determinationof nitroimidazolesresiduesin foodstuffs of animal origin声明：本资料仅供学习和交流，严禁用于商业用途！目录下载：http：//biaozhun.ys168.com2007-10-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
GB/T21318—2007
硝基味唑类药物主要包括4-硝基咪唑、异内硝唑、2-甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氛甲硝咪唑、地美硝唑，苯硝味唑，是一-类抗菌素和抗原虫药。硝基咪唑类药物在体内吸收快，所以标示残留物除了原形药物外，还包括代谢产物羟基甲硝唑MNZOH（甲硝唑代谢物）、羟甲基甲硝咪唑HMMNI2-甲硝咪唑、洛硝哒唑代谢物），它们具有损害细菌DNA和抗厌氧菌感染的功效。该类药物主要用于治疗和预防庆氧菌引起的局部或系统感染，抑制厌氧菌的DNA合成，也用于抗滴虫和阿米巴原虫等。由于硝基咪唑类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性，从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用。因此，硝基殊唑类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物。本标准提供了动物源食品中硝基咪唑类及代谢物的高效液相色谱/市联质谱多残留确证方法。声明：本资料仅供学习和交流，严禁用于商业用途！目录下载：http：//biaozhun.ys168.com1范围
动物源食品中硝基咪唑残留量
检验方法
GB/T21318—2007
本标准规定了动物源性食品中确基咪唑原药名种、代谢产物2种残留量的高效液机色诺/中联质谱测定方法。
本标准适用于猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾、鱼肉、奶粉、蜂囊中：4-硝基咪唑、异丙硝唑、2-甲硝踩唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氮甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝殊唑残留压及其代谢物羟基甲硝唑MNZOH(甲硝噬代谢物）、羟平基甲硝咪唑HMMNI(2-甲硝咪唑、硝哒壁代谢物）的测定。规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡起注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然闻鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用了本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-—1992，negISO3696：1987）3原理
样品中残留的8种硝基味唑、2种代谢物用甲醇-丙酮均质或超声波提取，经乙酸乙液液分配，以凝胶色谱（GPC)净化，再经固相苯取（SPE)净化，采用液相色谱/串联质谱确证，外标法定量测定。4试剂和材料
声明除来费有被供摩有减为分析禁内滴整角速62实的载级森tp：//biaozhun.ys168.com4.1甲醇：HPLC级。
4.2丙酮：HPLC级。
4.3乙酸乙酯：HPLC级。
4.4环已烷：HPLC级。
4.5氯化钠。
A.6无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，繁于密封容器中备用。4.7
甲酸：优级纯。
饱和氯化钠水溶液。
4.9硅藻±：80日120月。
Cl固相萃取柱：1.0g，6mL。
微孔滤膜：有机系0.45μm。
硝基咪唑原药8种、代谢产物2种标准物质：纯度均大于等于98%（详见附录A）。4.13
标准储备波：分别准确称取适量的每种标准物质，用甲醇配制成浓度为1000g/mL的标准储备液。该溶液应配制于棕色容量瓶中，在0℃4℃冰箱中可保存12个月。4.14泥合中间标准溶液：分别准确移取一定体积的每种标准储备液，用甲醇稀释成适当浓度的混合中间标推溶液。该浴液应配制于棕色容量瓶中，在0℃～4℃冰箱中可保存6个月。1
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4.15混合标准工作溶液：分别准确移取一定体积的混合中间标准溶液，可根据需要用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。该溶液应配制于棕色容量瓶中，在0℃~4℃冰箱中可保存3个月。5仪器和设备
5.1液相色谱-中联质谱仪：配电喷雾离子源中联四极杆检浏器。5.2凝胶色谱仪：配有馅份收集涨缩器。5.3组织捣碎机。
5.4均质器。此内容来自标准下载网
5.5超声波发生器。
5.6旋转蒸发器。
5.7高速离心机。
5.8氮吹仪。
5.9具塞锥型瓶：250mL。
5.10分液满斗，250mL。
5.11浓缩瓶：50ml250mL，
6试样制备与保存
6.1肌肉组织及器脏组织类、水产品类从原始样品中取出有代表性样品（脏器应别除筋膜）约500多，用组织摄碎机充分揭碎混勾，均分成两份，分别装人活净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于-18冷冻避光保存。6.2乳及乳制品类
从原始样品中取出有代表性样品约500，用组织捣碎机充分搞碎混勾，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于4冷藏避光保存。6.3蜂蜜
声明外乐样学有麦样品用子正还的样组势萨机宿α热班混6名m成两份，分别装入清净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于1C冷藏避光保存；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部化后用组织搞碎机充分揭碎混勾，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于4C冷藏避光保存。在融化时应注意防止水分挥发。在制样的操作过释中，应防止样品污染或残留物含尽发生变化。7样品处理
7.1提取
7.1.1肌肉组织脏器组织样品及水产品准确称取约208样品（精确至0.1B）于250ml具塞链形瓶中，加人10g硅藻上（4.9）与样品充分混，再依次加入5nL饱和氛化钠水溶液和70mL甲醇-内酮（3+1），高速均质提取3tain。将提取液移入离心管中，于10000/min条件下离心2min，将上层提取液移人250mL浓缩瓶中，残渣每次再用50mL甲醉-丙酮（3+-1)重复提取两次，合并提取液。7.1.2蜂蜜、乳及乳制品样品
分别准确称取约20g样品（精确至0.1g）于250mL具塞锭形瓶中，加入10ml.饱和氯化钠水溶液和70mL甲醇-丙两（3+1)，超产波提取30min。移人离心管中，于10000r/min条件下离心2min，2
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将上层提取液移人250mL浓缩瓶中。残渣每次再用50mL甲醇-丙（3+1）重复提取网次，合并提取液。
7.2液液分配
将7.1.1和7.1.2所得提取液于40℃水裕中旋转浓缩至只剩水相.并转移至250mL分液蒲斗中，加人50mL饱和氟化钠水溶液和23mL乙酸乙脂，振摇3min，静置分层，收集艺酸乙相。水相再用20mL乙酸乙酯重复提取两次，合并乙酸乙酯相。经无水硫酸钠柱脱水，收集于250mL浓缩瓶中，于40℃水浴中旋转浓缩至近于，加人5mL乙酸乙酯-环已烷（1十1)浴解残渣，并用0.45μm滤膜过滤，待净化。
7.3净化
7.3.1凝胶色谱(GPC)净化
7.3.1.1凝胶色谱净化条件
a）净化柱：700mmx25mm，BioBcadsSX3，或当者；b）流动相：乙酸乙酯-环已烷（1+1)：流速：4.7mL/min；
样品定量环：5.0mL
预淋洗体积：50ml；
洗脱总体积：210mL；
g）开始弃去体积：90mL：
h）收集体积：90ml；
最后弃去体积：30mL。
7.3.1.2凝胶色谱净化步骤
将5mL待净化液按7.3.1.1规定的条件进行净化，合并馏份收集器中的收集液手250mL浓缩瓶中，于40℃水浴中旋转浓缩至近干，加人5nL印醇以溶解残渣，待净化。7.3.2固相萃取（SPE）净化
使用前用5mL甲醇预淋洗Cs固相苯取柱，将5mL溶解液倾人C.周相萃取柱中，以1mL/min虚慢收集凝翻级借和交净醇进荐脱于酸紫墨静洗脱缓宇品教缩瓶串i4水器甲能浓缩至干。用甲醇浴解并定容至1.0mL，经0，45μm滤膜过滤后，供液相色谱/中联质诺测定和确证。7.4混合基质标准落凌的制备
7.4.1肌肉组织及脏器组织样品、水产品样品称取6份约20g阴性试样（精确至0.1g）于250ml具塞锥形瓶中，加人5mL饱和氛化钠水溶液和70mL甲醇-丙酮（3+1)，高速均质提取3min，于100001/min条件下离心2min，弃去上层提取液。按照最终定容浓度0.10、20.50、100.500ng/mL分别加人混合中间标准浴液（4,14）或准合标准工作液（4.15)、余下操作同7.1.1、7.2,7.3。7.4.2蜂蜜、乳及乳制品样品
称取6份约20g阴性试样（精确至0.1名）于250mL具塞形瓶中，按照最终定容浓度0、10、2050100、500ng/mL分别加人混合中间标推溶液（4.14）或混合标准工作溶液（4.15），余下操作同7.1.2.7.2.7.3.
8测定
8.1液相色请条件
a）流动相见表1；
b）进样量：10μL。
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时向/min
8.2串联质谱条件
参见附录 B。
8.3液相色谱/串联质谱测定
8.3.1定性测定
表1流动相条件
流速/(μL/mim）
甲醇/%
0.1%甲酸水溶液/%
对混合标推工作液及样液按上述规定的条件进行测定时，若检测样品的色谱峰保留时间与标准品致，且与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，对率度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。每种硝基咪唑的选择离子对的种类、相对丰度比见附录C。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子度
允许的受大偏差
8.3.2定量测定
>20%~50%
>10%~20%
根据样液中被测8种硝基咪唑、2种代谢物的含量，选定浓度相近的标推工作落液。标准工作溶液和待测样液中8种硝基咪唑、2种代谢物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对混合标准落液与样液等体积分组分时段参插进样测定。外标法定量微定。在上述液相色谱/中联质谱条件下，8种硝基腾哦，2秘代兜物标准物康的保盟时间见附录C液想免谱电联质谁总离子流色讲图见附录D下载：http./7biaozhun.ys168.com和文流，
8.4平行试验
按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定。8.5空白试验
除不称取试样外，均按照以上步骤进行。结果计算
按式(1)进行计算：
式电：
X, 4rXGXV×1 000
A,XmX1000
试样中硝基咪唑或代谢物：残留量，单位为微克每于克（g/kg）；A，一样液中硝基咪唑或代谢物的峰面积（或峰高）；c:标准工作液中硝甚味础或代谢物i的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；V样波最终定容体积，单位为毫升（mL)：A-标准工作液中硝基咪唑或代谢物i的峰面积(或蜂高)；最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。计算结果需扣除空白值。
（1）
10检出限（LOQ)
本方法的测定低限见表3。
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表3硝基咪唑原药8种、代谢物2种测定方法的测定低限及添加回收率范围测定低限和
药物名称
4硝基咪唑
异丙硝唑
2-甲硝味唑
格硝哒噬
甲碰唑
甲硝蛛唑
地美硝唑
苯硝咪唑
羟基甲硝唑
确证低限/
(tmg/kg)
回收率/%
73.0~76.8~
105.21112.6
75.2~80.9~
(MNZOH)
古甲费料仅供学习交说74.服用手b用检.6-日录下我2.t12（A12a2hn5.e681em咪噬
(HMMND
回收率和精密度
本方祛对稍基咪哗原药8种、代谢物2种的添加回收率见表3。104.0101.5
采用添加法，即对本底不含8种硝基咪唑原药及2种代谢物的猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾鱼肉、奶粉、蜂密样品，添分别为（0.5)1.0、2.0.4.0ng/g水平的样品进行回收测定，每水平单独测定10次，相对标准偏差在4.99%~22.41%范用内。5
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附录A
（资料性附录）
8种殖基唑原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式表A.18种硝基咪唑原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式序号
声明：
药物名称
4-硝基账唑
异丙硝唑
2-甲硝咪唑
裕硝哒呢
中硝唑
氯甲硫咪唑
英文名称
d-nitroimidazole
ipronidazole
2-methyl-5-nitroimidezole
ronidazole
metronidazole
5-chloto-1-inethyl-4-nitraimid-azole
CAS号
3034-38-6
11885-29-1
88054-22-2
7681-76-7
443-48-1
4897-25-0
分子式
CHuN,O2
C,H,N,
结构式
柑对分子
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地美硝唑
苯硝咪唑
径基甲硝唑
(MNZOH)
羟甲基甲硝
(HMMND
dimetridazole
5-nitrubenzimidazole
1-( 2-hydroxyethyl )-2-hydroxymethyl-5-nitroimidazole
2-C 2-hydraxyruethy-5-nitro-in1-idazote-1-yl)-ethanol
1-methyl-S-nitro-1H-imidazole2-hydroxymethyl-1-methyl-5-
nitro-imidazole
551-92-8
94-52-0
4812402
936-05-0
CllN,O
CsHN,O
附录B
（资料性附录）
液相色谱/串联质谱条件
色谱柱：ZORBAXSB-C，150mmX2.1mm，3.5μm，或相当者，柱温：30℃：
电离方式：电喷雾（ESI)：
扫描方式：正离子扫描：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5500V；
筹化气压力：0.21MPa;
气帘气压力：0.088MPas
辅助气压力：0.062MPas
离子源温度：550℃
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时录C
【资料性录】
8种硝基咪唑原药及2种代谢物的保留时间、选择监测离子设定参数表表C.18种硝基咪唑原药及2种代谢物的保留时间、选择监测离子设定参数表序号
声明：
药物名称
4-硝基味唑
羟基甲硝唑（MNZOH)
2-甲硝殊唑
羟甲基甲硝嗪唑（HMMND
甲硝噬
资硝哒唑
地美硝唑
甲硝味咪唑
保留时间/
本资料仅供学习和交流，
苯硝咪唑
异丙硝唑
笼量离子对
114.0/83.7
187.7/123.3
128.0/41.9
157.8/140.2
172.0/81.7
201.1/54.8
142.0/95.9
161.9/115,8
定性离子对
114.0/67.9
114.0/83.7
187.7/123.3
187.7/126.2
128.0/41.9
128.0/81.6
157.8/140.2
157.8/55.1
172.0/127.8
172.0/81.7
201.1/139.7
201.1/54.8
142,0/95.9
142.0/80.7
161.9/115,8
碰控气能盘/
去籁电压/V
相对强度
（苯峰)/%
严禁用于商业用1.明绿时载：绍ttp://biaozhun.ys168.com10.0
163.9/117.8
169.5/124.3
163.9/117.8
163.9/90.9
169.5/124.3
169.5/109.1
I所列参数是在API4000质诺仪究成的，此处列出试验用仅器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业日的，效励标准使用者尝试不同厂家和型号的议器，8
附录D
（资料性附录）
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8种硝基咪唑原药及2种代谢物的液相色谱/串联质谱总离子流色讲图10
1——4-硝基味唑：
羟基甲碟哗(MNZOH)：
声明:-本精解继学习和交流，严禁用于商业用途！目录下载：http://biaozhun.ys168.com4-羟甲基甲研咪唑(HMMNI)；
甲硝唑；
格硝哒唑：
地美硝唑：
氧甲硝咪唑；
本硝味唑！
异丙硝唑。
图D，］8种硝基咪唑原药及2种代谢物的液相色谱/串联质谱总离子流色谱图
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