【国家标准(GB)】 动物源性食品中青霉素族抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法

1CS 67. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T21315—2007
动物源性食品中青霉素族抗生素残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法
Delermination of penicillius residues in foodstufls of animal origin-LC-MS/MS meihod
2007-10-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
数码防砖
2008-04-01实施
本标准的附录 A、附录B.附录 C为资料性附录。本标准由中华人民其和国国家质量监督检验检疫总局提出并门。GB/T21315—2007
本标雅起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标雅正要起草人：林维宣唐英章、李一坐、赵彤彭,彭涛、田毕、于足、李年孙兴权，本标难为首次发布。
1范围
动物源性食品中青霉素族抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法GB/T21315—2007
本标推规定了动物源性食品中青每素族抗生素残留量液色-质泄/质谱测定和确证方法。木标雅适用」猪肌肉、猪肝脏,猪肾脏、牛奶和鸡蛋中胫氨青素（amoxicyllin）、氨苄霉素（arnpicillin）、邻氟背素（claxicilin）双氣青等索（diclaxacillin）乙氧蔡胺青莓素（natcillin）、苯唑有霉索（oxacillin）卡肯霉素（gpenieilin）、苯氧甲基青霖素（penici!lin）、苯咪背霉素（azlocillin）、中氧苯霖素(meilicillin)、苯氧乙基背霉素（phenethicillin)等11种青霉素族抗牛素残留量的检测。2规范性引用文件
下列文件中的象款适过本标准的引用前成为本标准的条款。凡是注门期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括谢误的内容)或修订版均不适用十本标准，然而，鼓励根据本标达成协议的各方研究足否可使用这些文件的最新版本。凡不注日期的引用文件，其最新版本适用上本标准，GB/T6682-19S2分新实验室雨水格和试验方法（negISO 3696:1937)3原理
样品中背案素族护牛素残留物用乙睛尽溶液提取，摄取液经浓缩后，用缓冲落液溶解，面相萃取小柱净化，洗脱液经氮气欣干后，用液相色谱-质谱/底谱测定，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GI/T6682-1992规定的--级水，4.1乙脆：高效液相色谱级。
4.2甲醇;高效液相色谱级。
4.3甲酸：高效液相色谱级。
4.4氯化钠。
4.5氨氧化钠。
4.6磷酸二氢钾，
4.7磷嵌氢二钾：
4.80.1mo/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1C00ml.。4.9乙膜「水(15-+2.体积比）。4.10乙腊十水（30十70体积比）4.110.05mal/L磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5):称取8.7g磷酸氧二钾,超纯水溶，稀餐至1C00mJ.用磷酸二氢钟调节 pH至 8.5±0. 1 4.120.025rmnl/1.磷酸盐缓冰溶液（pH=7.0)：称取3.4g磷酸二氢钾，趋纯水溶解，稀释至1000mJ.用氢氮化钠调节pH至7.0士0.1。4.130.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5）：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至1000ml..用甲酸调节 pH 至 4. 5二 0. 1。
4.141门种青哥案族抗牛素标谁品：轻氨早霉素、氨柔肯霉条，邻氣背妻，双氯青霉素，之筝奈胺青GB/T21315—2007
氨素,米唑青霉素、下青素、米氧甲青霉素、米咪古霉素、甲氧苯青霉素、米氧乙基青每素，纯度均大于等于95%。
4.1511种背毒素族抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品(4.14）,分别月乙睛水溶液（4.1C)溶解并定容至全100 mL、各种青群素族抗生素浓度为100 μg/mL,置于一18C冰箱避光保存,保存期5d4.1611种青霉系族抗生素混合标准中间溶液：分别吸取适量的标准谐备液（4.15)于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液(1.12)定穿至刻度，配成混合标准中间溶液：各种青薇素族抗尘素浓度为：羟氨芒青露素500ng/mL，氮芊肯蒂素200ng/ml,苯咪青密素100 ng/mL,甲冠苯方薇素10ng/ml，芋育爵素【00ng/mL,苯氧甲基背霉素50ng/ml.,苯醇青霉素20cng/mL，苯氧乙基肯粪素1cC0ng/ml.,邻氯青需素100ng/ml.,乙氧萘青需素20ng/mL,双氯节霜素10ng/ml.，暨于一4℃冰箱避光保存，保存期5d.
4.17混合标推工作溶液：准靠移取标准中日溶滚（1.16)适量.用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标滩工作溶液（用时现配）4. 18(DasisIn.B固相子或相当者,500mg,6mL。使用能用中障和水预处理，即先用2mL甲小杯洗小样
醇淤洗小柱.然后用1
5仪器
液相色谱-质请/质售仪：配有电喷雾离5.1
旋转蒸发器
固柏苯取装
离心机。
5.5均质器。
旋褐混台器
5.7 pH计.
5.8氮吹仪。
6 试样制备与保存
吸代表性样品，尺够碎机充分揭酪.装人清争容器中，密封，并标明标记万一18C以下冷冻ON
存效。
7检测步骤
7.1提取
7.1.1肝脏、肾脏、肌肉组织、鸡蛋样品称取约5g试样（精确到0.C1g）于50mL离心管，加人mL乙睛水溶液（4.9），均质30s，40001/mir离心5min，上清液转移至50mL离心管中，另取·离心管，加人10tml.乙睛水溶液（4.9），洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管巾的沉淀，如人「述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器」振落1min,4000r/min离心5min上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液(4.9)漆刀头并提取-~次，上清液合并至 50 ml 离心管中,用乙腈水溶液(1. 9)定容至 40 mL。准确移取20 mL人100 ml.鸡心瓶，
7.1.2牛奶样品
称取10g样品（精确到C.01g）于50mL离心管中，加人20mI.乙睛（4.9），均质提取30S，4000 r/min离心5 main,上消液转移至50 mL离心管中：另取一离心管，加入10 mE.乙脐水溶液（4.9)，洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，划人上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振1mi.40001/min离心5rnin，「清液合并至50mL离心管中，重复用10m乙睛水溶液<4.9)洗涤刀2
GB/T 21315-2007
头证提取一次，上消液合并至50mL离心管中，用之膜水溶（4.9)定容至50mI准确移取25mL人100 mL鸡心瓶。
将鸡心瓶于旋转蒸发器上（3？C水浴)蒸发除去乙.情（易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液）。7.2净化
立即向已除去乙睛的鸡心瓶中加入 25 mI,磷酸盐缓冲溶羧(1.11).涡旋混匀 1 min,用 0. 1 mol/1.氢氧化钠调plI为8.5,以1ml/min的遗度通过经过预处理的相萃取,先用2 ml.磷酸盐缓冲溶液(1. 11)淋洗 2 次,再用 1 ml.超纯水淋洗,然后用 3 mL乙腈洗脱(速度控制在 1 ml/ min)。将洗脱液上15℃下氯气吹下，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12)定容至1ml过0.45um滤膜后，立即用液相色谱-质谱/质谱仪测定。
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
7.3.1. 1 色谱柱:Cjs柱,250 mm×4.6 m(内径）,粒度 5um·或相当若。7. 3. 1. 2流动相:A组分足 0. C1 mol/1. 乙酸铵溶液(甲酸调 pI 竿 1. 5);B组分是乙肺。梯度洗脱程序见表1。
梯度洗脱程序
时旬/mie
7. 3. 1. 3 流速:1. 0 mL/ rin.7. 3. 1. 4 进样量:100 μL。
7.3.2质谱条件
7.3.2.1离子源：电喷雾离子源。7.3.2.2扫描方式：正离子扫、
7.3.2.3检测方式：多反应监测，流/nL/ma)
距分A/%
绍分3/炎
7.3.2、4雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气：使用前应调节各参数使质谱灵敏度到检测要求.参考条件见附录A。
7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定
根抛试样巾被测物的含量情况·选取响应值相迈的标难工作液一起进行色谱分析。标难工作液和待测液中青无素族抗生素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体只逊行测定。作上述色谱条件下，11种育霉素的参考保留时间分别约为：经氨肯露素8.5㎡in，氨芋青素12.2 min,术咪青霖素 16. 5 min,甲氧苯市露素 15. 8 min，苯青霉素 18. 1 mir:米氧甲基青冠素19, 4 min,米唑背霉素 20. 3 min,苯氧乙基古窗素 20. 5 min,邻氯青群素 21. 5 min,乙氧茶青霉素22. 3 min,双氯青霉素 23. 5 min。青露素族抗生素标难溶滋的定量离子对重构离子色谱图见图 B. 1。7.3.4定性测定
按照上述条件测定样品和建立标难工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准液相比在士2.5%的允许偏差之内；待测化合物的定性离了对的重构离子色谱峰的信躁比大于或等于33
GB/T 213152007
(S/N)3),定量离子对的重拟离子色谱峰的信噪比人于或等于[0(S/N210):定性离了对的相对丰度与浓度树当的标准溶液相比,相对半度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的日标化合物。
表 2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离了非度
允许的相对确差
7.3.5定量测定
≥50%
>20%～30%
按外标法使用标准工作成线进行定量测定、7.3.6空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行HIN
结果计算与表述
换1计算试
用色谱数据处机
武中：
试祥中青冠京族残留量
一从标准肥线
一样液最
德蒸族
单位为微
克年于克（ug）
2>10%~20%
±30岁
留量，计算结果壳扣除空凹值：.-(1)
器素族残留溶液浓度，单位为纳克舒毫升（ng/nL）得到的青
答体积，单位为毫
最终样表的试样质
测定低限与回
9.1测定低限(LOQ)
，单位为克（8)
11种背零素战素的测定低限分别为经氢下青氮下青素2/kg，苯咪背霉素
素5产g/kg
pg/kg，卡
东青霖素工
1ng/kg.中氧举背霜
氧素00
C.5μ/V，苯坐育露素2μg/kg，氧甲基青需素
kg，双氯青露10ug/kg。
邻氯言霉素1#g/kg.艺
茶青素2品
9.2回收率
见表 C.1 和表 C.
质谱/质谱测定参考质谱条件：
电喷雾电压(IS)：55C0V；
附录A
（资料性附录》
质谱/质谱测定参考质谱条件！
雾化气压力（GS1）：0.483MPar7oPs气帘气压力(CUR)：0.207MPa(35Psi)；GB/T 21315--2007
辅助气压方（GS2）：0
621MPa(oPsr
于对,泌显高(, 尿低气配能(C)程脏e
离广源温度(TEM）：
11.种青霉素族
青霉责族素的定性离子对，定量离子对、去藤电压，碰撞气能量和碰播室出口电压定性离子双
组分名称
轻氨卡育素
辛味青霉素
三来育
甲基素
苯唑青霉素
苯敏乙基青霉素
邻氯肖轰素
乙茶肯需
双背莓素
3067349
306/2:08
3537135
355/192
462/218
1627228
3817:65
381/222
335/160
335/175
51/160
387/228
436/277
435/160
415/199
415/256
4527182
402/333
定量离子欢
65/349
881/165
102/160
9877228
467277
415/199
470/160
上德电压
碰童气能
避撞牵出山电压
(CxP)/V
1）所列参数是在API 4000质谱仪完成的,此处列出的实验门仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业口的,鼓励协准用者尝试术间型号的仪器。GB/T21315--2007
5. 0:5号
6. 0025 5
附录B
(资料性附录）
11 种青霉素族抗生素标准品的定量离子对重构离子色谱图8.51
20 22-
28 30
2 —222 — 20
0222426280
262830
图B.111种青霉素族抗生素标准品的定量离子对剪构离子色谱图6
1. 00c5 -
6. orle4 -
4. 400e:4 -
2. 00e4 -
stla/g
图B.统）
GB/T 21315-2007
228--30
GB/T21315—2007
附录C
（资料性附录
添加回收率
表 C.111 种青霉素旅抗生素在猪肉、猪肝,猪肾中的添加回收率化合物
羟氨茅青幕素
氨花有霉素
深味青素
甲机吉都
卡专海装
茶教甲基素
苯唑青霉素
基德素
邻氨青葬素
乙氧蔡市
双氣青薇素
淤加浓度！
(μg/kg)
74. 6 -86. 0
73. C-89. H
73. 3 ~ 90. 2
71. 5~94. 0
71. 0--93. 5
7+. 2-~87.
7.0 ---. c
73.3-85.1
73.0--83.1
T,c--$4,c
73. 0 - 83. 0
81.3-- 94.2
72. 0~8:, c
72. 5 ~-87. 3
73. 4 ~-51. 3
72. c~-88. C
72. 2~.90, 6
73. 8-~85. 2
70.0--76.0
67. 0--81. 5
77. 0~9c. 2
70.2---86.5
73. 8 ~- 36. 5
79. 2~.9n. 4
72. C~851. 0
74. 7 ~88. 5
76.2~-88. 1
71. 0-89. c
64.5-~84.5
68. 5~82. 6
62.5--83. 7
77.7-87.3
76. 6--82.7
平均回收幸/光
51.C-~86. 8
73.0--89.6
70. 5 ~ 90. 3
68. 5 ~87. 5
68,5+-94. 0
69.2~-88.9
53.0~-83. 0
71. 5~-82.1
72. G~-87. C
63. c85. c
73.0~87.0
73.5~33.3
71.0-80.0
75. 3--87. 6
72. 2 ~85.7
64. t~-88. 0
73.4--90. 6
74. 2-- 54.8
65.5 ~85.0
70.0--89.0
70.1~88. 7
61.7~81.0
74.0 ~87.8
77.8 -89.2
63.c83. 0
77. 0--88. 7
73.2--87.3
64.0--87.5
72. 5~87. 5
76. 2 ~ 89. 5
71.8-~88.0
75.6~87.3
53 8-~56. 2
76.2-86.8
70.8--90.9
68.5---81,5
72.0--50. 5
75. 0 ~8.2
67, 0 ~81. 7
70. 9~-95. 9
73.5~-85. 5
55.0~87.0
76.0---89.0
77.4--87. 8
66.0-34.0
73. 5 --87. 5
77. 5--88. 4
72.0--88.0
69. 6-~89. 0
71.2 ~55.0
72.5~87.5
75. 5~- 93. 5
71. 3~- 7. 6
77.5~~86. 3
71.5--89.3
78. 1-~89. 3
66.0~-85.0
74.2--85.1
77. 6 89. 4
68. 0~84.5
75. 5~ 89.5
77. 3~ 9G. 6
66.1~83.3
74. 2-~H7. 1
78.1--87.1
化合物
羟氨节青霉素
氨卡青霖素
年青爵素
甲氧莱背霉素
卡古霉素
老氧甲基青葡素
苯唑肖葬素
苯氧乙基专素
邻氯青霉素
乙氧茶青霉素
双如霉素
表 C. 211 种胃霉素族抗生素在牛奶,鸡蛋中的添加回收率添加浓度/
(μg/xg)
52.4~-84.8
75. 2 ~-88. 8
73.5~-92. 5
69. 0--87. c
73. 9~87. 5
77.488. 5
68. 0-~88. 0
73. 4 ~90. 4
77, 4--91. 0
56. 0--82. 0
74. 0--88. c
76.4~91. 6
64. 0-86. 0
74. 2-~90.2
77,0~-90. 6
04.0~83.0
74.8---95.0
79.8~~95.0
8.0--83.0
76. 4--87.
76. 9 ~-89. 6
66. 6~-83. 4
71. 8~.91. 3
73. 0 ~S1. 4
66. 0 ~8-1. 0
77.2--90. 6
78. 4-~92. 0
68. 0--84.0
75, 5--86. 1
79.3~-8.5
66.8~-83.0
74, 2--90, 8
75.0~92.9
均回收率/%
GB/T21315—2007
71.6--91.6
68.1-98.5
68.0--85.0
71.5~-88. 7
76.1~-88.1
72. 0~83. 0
76.6~90.0
78.0~-92.4
72. 0--84. 0bzxZ.net
74.0-88.0
73. 2 --91. 2
76.0~-96.0
73.0~-93.0
74.2~91.4
68. 0 --32, 0
70.8--95.8
67.0~88. 0
75.5 ~90. 3
77. 7---52. 5
68. 2 --86. 4
77.2--93. 2
76.2 ~-92.5
66.0-88. 0
70, 6~~90, 6
72.8~90.4
69.0~88.0
75. 4 ~- 8. 6
77.0-~94.5
68. 8--83. 4
73. 2 --89. 2
71.2~-58. 7
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