【国家标准(GB)】 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法

ICS67.120
中华人民共和国国家标准
GB/T21323—2007
动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法
Determination of aminoglycosides residues in animal tissues-HPLC-MS/MSmethod
2007-10-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T21323—2007
本标准起草单位：中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、湖南师范大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：黄志强、林黎明、张鸿伟、张莹、陈波、彭涛、李晓娟、王美玲、颜鸿飞。1范围
动物组织中氨基糖类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法
GB/T21323—2007
本标准规定了动物组织中壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那需素、安普霉素、妥布霉素，庆大霉素和新素10种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定和确证方法。
本标准适用于动物内脏、肌肉和水产品中10种氨基糖苷类药物残留量的测定2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括助误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格利试验方法（GB/T6682-1992，neq1SO3696：1987）3原理
试样中氨基籍苷类药物残留，采用磷酸盐缓冲液提取，经过C固相萃联柱净化，浓缩后，使用七氟丁酸作为离子对试剂，高效液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，4.1甲醇：液相色谱级。
4.2冰乙酸：液相色谱级
4.3甲酸：液相色谱级。
4.4七氟丁酸：纯度≥99%。
4.5浓盐酸。
4.6氢氧化钠。
4.7三氯乙酸：纯度≥99%。
乙二胺四乙酸二钠（Na.EDTA）：纯度≥99%。4.8
磷酸二氢钾。
4.10七氟丁酸溶液（HFBA）：100mmol/L，准确量取6.5mL七氟丁酸（4.4），用水稀释至500mL（4℃避光可保存6个月）
4.11七氟丁酸溶液：20mmol/L，准确量取100mmol/L七氟丁酸溶液50mL（4.10），用水稀释至250mL（4℃避光可保存6个月）。4.12磷酸盐缓冲液（含0.4mmol/LEDTA和2%三氯乙酸溶液）：准确称取磷酸二氢钾（4.9）1.36g用980mL水溶解，用1.0mol/L的盐酸调pH到4.0，分别加人NazEDTA（4.8）0.15g和三氯乙酸（4.7）20g，溶解混并定容至1000mL（4℃避光可保存1个月）。4.13甲酸：0.1%（体积分数），准确吸取1.0mL甲酸（4.3）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
GB/T21323—2007
4.14壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霖素、新霉素标准品：纯度范围92.0%～99%。4.1510种氨基糖苷类药物标准贮备液：分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品（4.14），用水溶解，配制成浓度为100ug/mL的标准贮备溶液（4℃避光可保存6个月）。4.1610种氮基糖苷类药物混合标准中间溶液：分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大素标准贮备溶液（4.15）各1.0mL，新霉素、潮霉素B、安普需素标准贮备溶液（4.15）各5.0ml，于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成壮观霉素、双氢链霉素、链霉素，丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0ug/mL，新霉素，潮霉素B和安普霉素浓度为20.0g/mL的混合标准中间落液（4℃避光可保存1个月）4.1710种氨基糖苷类药物标准工作溶液：精密量取标准中间溶液（4.16）适量，用空白样品基质配制CHINA
成不同浓度系列的混合标准
容液（现用现配）
固相萃取Cl.柱：500
5仪器
事联质谱仪：配有电喷雾离子源高效液相色谱
高速组织捣码
5.3均质器。
旋转蒸发器
氮吹仪。
pH计。
分析天平：推
真空泵。
离心机。
01mg和o.
试样制备与保存S
6.1试样制备
18各一台。
样品经高速组织搞运均匀碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装人情洁容器内，加封后作为留样。
6.2试样的保存
将试样于-18℃下保存
7测定步骤
7.1提取
称取约5g（精确至0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加人10.0mL磷酸盐缓冲被（1.12)均质2min，于平板振荡器上振荡提取10min，离心10min（4500r/min），将上清液转移到另一个50mL聚丙烯离心管中。在残渣中再加入10.0mL磷酸盐缓冲液（1.12），重复上述操作，合并上清液，用1.0mol/L的盐酸调pH值为3.5士0.2，加人2.0mL七氟丁酸溶液（4.10)，涡旋混匀，7.2净化
C固相萃取柱用3.0mL甲醇（4.1）3mL七氟丁酸溶液（4.11）淋洗后，将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s，先用3mL七氟丁酸溶液（4.11）淋洗，再用每次3mL水淋洗两次，奔去淋洗液，抽干5min。用5mL乙睛-七氟丁酸溶液（4.11）（80+20，体积比）洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中，10℃氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液（4.11）定容至1.0mL，涡旋混勾后，过0.2μm微孔滤膜，液相色谱-质谱/质谱测定。2
7.3测定
7.3.1标准工作曲线制备
GB/T21323—2007
制备混合标准浓度系列，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素分别为50ng/mlL、100ng/mL250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素分别为300ng/mL，500ng/mL、1000ng/mL1500ng/mL、2000ng/mL，按7.3.2条件测定并制作标准曲线，10种氨基糖苷类药物的CAS号和在7.3.2色谱条件下测得的色谱保留时间参见表B.1。7.3.2液相色谱条件
色谱柱：Ca柱（可用IntersilODs3，粒径5pm，柱长150mm，内径4.6mm或相当者）；a)
流动相：甲醇+水+100mmo1/LHFBA（梯度洗脱），证动相组成和洗脱梯度见表1；b)
时间/min
L/ming
进样量
质谱条件
参见附录A。
7.3.4液相色谱-串联质谱测定
表1流动相组成和洗脱梯度
甲醇/%
100mmol/LHFBA/%
7.3.4.1定性测定
按照上述条件测定样有立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色着峰的保留时间与标准溶待测化合物的定性离子对的重构离子谱峰的信噪比大于或等于3液相比在士2.5%的允许偏差之
(S/N≥3)，定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10(S/10);定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的目标化合物。10种氨基糖苷类药物标准工作液的定量离子对的重构离子色谱图参见图B.1~图B.10。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
7.3.4.2定量测定
>20%~50%
按外标法使用标准工作曲线进行定量测定。7.4空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7.5结果计算
>10%~20%
试样中每种氨基糖苷类药物残留量利用数据处理系统计算或按式（1)计算：≤10%
GB/T21323—2007
式中：
X一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）：V
试样溶液所代表的质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。
检测低限（LOQ）
（1）
壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那素、妥布霉素、庆大霉素为20μg/kg，新霉素、潮霉素B、安普霉素为100μg/kg。9回收率和精密度
9.1鱼肉
9.1.1壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布需素、庆大霉素添加水平为20μg/kg时，回收率范围为72.1%~94.7%添加水平为30μg/kg时，回收率范围为71.4%~95.4%。添加水平为40μg/kg时，回收率范围为71.1%~98.0%。9.1.2新霉素、潮霉素B、安普霉素添加水平为100μg/kg时，回收率范围为70.1%~93.6%添加水平为150μg/kg时，回收率范图为70.4%~93.0%。添加水平为200μg/kg时，回收率范围为69.1%~94.5%。9.2鸡肉
9.2.1壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素添加水平为20ug/kg时，回收率范围为73.1%~94.5%。添加水平为30ug/kg时，回收率范围为74.0%~97.9%添加水平为40g/kg时，回收率范围为72.7%~98.3%。9.2.2新霉素、潮霉素B、安普霉素添加水平为100μg/kg时，回收率范围为70.3%102.6%。添加水平为150μg/kg时，回收率范围为71.4%~95.2%。添加水平为200μg/kg时，回收率范围为72.3%~96.0%9.3猪肾
9.3.1壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那需素、妥布霉素、庆大霉素添加水平为20μg/kg时，回收率范围为72.1%~95.5%。添加水平为30μg/kg时，回收率范围为73.0%~96.2%添加水平为40μg/kg时，回收率范围为70.7%~99.3%。9.3.2新霉素、潮霉素B、安普霉素添加水平为100μg/kg时，回收率范围为73.9%～99.3%。添加水平为150μg/kg时，回收率范围为71.4%~98.2%。添加水平为200μg/kg时，回收率范围为73.0%~105.0%。4
质谱/质谱测定参考质谱条件：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压：5000V；
雾化气压力：0.276MPa；
气帘气压力：0.207MPa；
辅助气压力：0.448MPa；
离子源温度：500℃；
附录A
（资料性附录）
质谱/质谱测定参考质谱条件
定性离子对、定量离子对碰撞气能量和去簇电压，见表A，1GB/T21323—2007
表A，1氨基糖苷类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去电压定性离子对
壮观霉素
(spectinomycin）
潮霉素B
(hygromycinB)
双氢链霉素
(dihydrostreptomycin)
链霉素
(streptomyein)
丁胺卡那霉索
(amikacin)
卡那霉素
(kanamycin)
安普霉素
(apramycin)
妥布霉素
(tobramyein)
庆大霉素
(gentamycin)
新霉素
(neomycin)
（母离子/子离子）
333.3/140,2
333.3/189.2
528.3/177.3
528.3/352.2
584.3/263.3
584.3/409.3
582.4/263.3
582.4/407.4
586.4/425.3
586.4/324.2
485.3/163.2
485.3/324.2
540.5/378.2
540.5/217.2
468.4/163.2
468.4/205.2
478.4/160.2
478.4/157.3
615.4/293.3
615.4/323.3
定量离子对
（母离子/子离子）
333.3/140,2
528.3/177.3
584.3/263.3
582.4/263.3
586.4/425.3
485.3/163.2
540.5/378.2
468.4/163.2
478.4/157.3
615.4/293.3wwW.bzxz.Net
碰撞气能量/eV
去簇电压/V
所列参数是在AB14000质谱仪完成的，此处列出的试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓1
励标准使用者尝试不同型号的仪器。5
GB/T21323—2007
附录B
（资料性附录）
标准样品定量离子对重构离子色谱图14.31
246810121416182022242628303234t/min
壮观霉素重构离子质量色谱图
246810121416182022242628303234t/mn
图B.2潮霉素B重构离子质量色谱图2.5e5
246810121416182022242628303234/min
双氢链霉素重构离子质量色谱图14.85
18.1420.002.222.32
468101214161820222426283032349
链霉素重构离子质量色谱图
246810121416182022242628303234t/min
6丁胺卡那霉素重构离子质量色谱图图B.5
临1515.821.22232210
46810121416182022242628303234t/min
卡那霉素重构离子质量色谱图
246810121416182022242628303234/min
安普霉素重构离子质量色谱图
做3.0e4+
246810121416182022242628303234t/min
图B.8妥布需素重构离子质量色谱图1.8e4
246810121416182022242628303234t/min
庆大霉素重构离子质量色谱图
GB/T21323—2007
GB/T21323—2007
化合物名称
壮观霉素
(spectinomycin)
潮霉素B
(hygromycinB)
双氢链等素
(dihydrostreptomycin)
链霉素
(streptomycin)
丁胺卡那募素
(amikacin)
246810121416182022242628303234t/min
图B.10新霉素重构离子质量色谱图表B.1
110种氨基糖苷药物参考保留时间及CAS号保留时间/
GB/T21323-2007
CAS号
21736-83-4
31282-04-9
5490-27-7
3810-74-0
37517-285
化合物名称
卡那筝素
(kanamyein)
安普霉素
(apramycin)
妥布等素
(tohramycin)
庆大雾素
(gentamycin)
新霉素
(neomycin)
保留时间/
CAS号
25389-94-0
1445-69-8
32986-56-4
1405-41-0
1405-10-3
版权专有侵权必究
书号：155066：1-30849
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