【国家标准(GB)】 伪狂犬病诊断技术

GB/T 18641---2002
伪狂犬病（pseudorabies，PR；Aujeszky'sdisease，AD)是危害猪、牛、羊、狗、猫、家兔等多种家畜和野生动物的一种急性传染病。除猪以外的动物感染伪狂犬病病毒后，主要是以发热、奇痒和脑脊髓炎症状为特征.以死亡为结局，并呈散发形式。本病对养猪业危害最大，猪感染后可引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎；仔猪大量死亡，15日龄内死亡率为100%，断奶仔猪死亡率10%～20%，种猪不育，母猪返情，空怀，公猪睾丸发炎肿胀、萎缩、失去种用能力；育肥猪增重缓慢、饲料报酬降低。本病呈世界性分布。
本标准规定的病原学诊断方法主要用于死亡动物的病料检测和活体动物的鼻拭子样品检测，其中聚合酶链反应具有快速、灵敏的特点，可用于大批样品的检测。血清学诊断主要用于非免疫动物的诊断、血清流行病学调查和免疫动物的抗体水平监测。中和试验特异性强，是国际通用的法定方法，可用于！！岸进出口检疫；胶乳凝集试验，简便快速、敏感性高、特异性强，适用于基层现场检测；酶联免疫吸附试验适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。本标准的附录 A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录,附录E是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标推由金国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准由华中农业大学畜牧兽医学院负责起草，农业部动物检疫所参加起草。本标准主要起草人：陈焕春、何启盖、李晓成、吴斌、方六荣、金梅林、邱德新、吴美州。154
1范围
中华人民共和国国家标准
伪狂犬病诊断技术
Diagnostictechniques forAujeszk'sdisease本标准规定了伪狂犬病的诊断方法。GB/T18641--2002
本标准适用于猪、羊、犬、猫等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测；中和试验，酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测；胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的草期检测。
2病毒分离鉴定
2.1试验材料
改良最低要素营养液（DMEM)培养基配方见附录A（标准的附录），仓鼠肾细胞（BHK21）或猪肾细胞系（PK-15）细胞，新生筷牛血清，青霉素，链霉素，0.22μm微孔滤膜，细胞培养瓶。2.2操作步骤
2.2.1病料的采集：对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、肺等组织，冷藏送实验室检测。2.2.2样品处理：待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加人灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DMEM培养液（见附录A）制成1：5乳剂，反复冻融三次，经3000r/min离心30min后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，加人青霉素溶液至最终浓度为300IU/mL、链霉素为100μg/mL，-70℃保存作为接种材料。
2.2.3病料接种：将病料滤液接种已长成单层的BHK21细胞（或PK-15细胞），接种量为培养液量的10%，37（恒温箱中吸附1h，加人含10%新生犊牛血清（包经过56C水浴灭活30min，过滤除菌，无支原体）的OMEM培养液，置3?C温箱中培养。2.2.4观察结果：接种后36h~72h，细胞应出现典型的细胞病变效应(CPE），表现为细胞变圆，拉网、脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬病病毒检测阴性。
2.2.5病毒的鉴定：将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或作进一步鉴定。
3聚合酶链反应
3.1试验材料
蛋白酶K，十二烷基硫酸钠（SIDS），苯酚，三氯甲烷，异戊醇（分析纯），溴化乙锭（EB)，TEN缓冲液【见附录B(标准的附录)]。
物：扩增伪狂犬病毒基因中434~651碱基对（bp）之间217bp>基因片段，序列为：.上游引物Pl中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002~02-19批准2002-05-01实施
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5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3',下游弓物P2:5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'。3.2操作步骤
3.2.1样品的采集：对于病死或扑杀动物，取大脑和三叉神经节、篇桃体、肺等组织：对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸人猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测。3.2.2样品处理每份样品分别处理。采病料经组织研磨器充分研磨，按1：5用TEN缓冲液（见附录B中B1）悬浮收集于离心管内，反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻拭子，则加人2ml.TEN缓冲液，充分挤压，取出棉拭子，7000r/min离心5min，取上清液472.5ul.，加人25μl10%t二烷基硫酸钠（见附录IB中B4)和2.5μI.的20mg/mI.蛋白酶K（见附录B中B3）.50C水浴摇床上放置2h后加人等量的饱和酚溶液500μL，涡旋20s，离心取上清液，加等量的酚：三氯甲烷：异成醇（25：24：1）抽提--次，再用等量的三氯甲烷：异成醇（24：1)抽提-次，最后用两倍的无水乙醇沉淀，真空抽干后加人20叫l双蒸水溶解（此邸为“模板\），一20C存备用。3.2.3聚合酶链反应（PCR）的操作程序：先将制备的模板DNA置100C水浴10min作变性处理，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系（按摩尔浓度计算）为：总体积25ul.，含有50mmol/I.（氯化钾）（KCl）10mmol/I.三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl)(pH9.0),0.1%三羟甲基氨基甲烷溶液（0.1%Triton X-100),100 μmol/LdNTPs,0.35 umo1/1引物,2mol/L氯化镁(MgC1z),及0.5U台克(Taq)DNA聚合酶，2μL.模板DNA。
最后加人矿物油约20μl覆盖。
扩增条件为；94C变性3min，进人循环，94C60s，65C60s，72C60s，40个循环后72C延伸5min。3.2.4PCR产物的检测：将样品分别加于1%琼脂凝胶板的各样品孔中，有-孔加标准阳性样品，每孔10μl.15μlPCR扩增产物，进行电泳，溴化乙锭（见附录B中B2)染色，在紫外光下观察结果。电泳区带迁移率与标准阳性样品区带迁移率相同的待检样品应判为阳性。为进--步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现140bp和77bp两个片段4家免接种试验
4.1家免的选择
选择健康成年家兔，用血清中和试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测，证实为伪狂犬病抗体阴性。
4.2病料的采集及处理
无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用灭菌生理盐水配成1：5乳悬液，反复冻融2～3次后，以3000r/min离心10min，取上清液加入青霉素和链素溶液，最终浓度分别为100IU/mL和100ug/mL，置4C冰箱中作用12h，作为待检样品。4.3病料接种
将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家兔接种1mL～2mL。4.4结果观察和判定
4.4.1伪狂犬病毒感染阳性：被接种动物在接种后24h~48h注射部位出现奇痒，家免啃咬注射局部，导致皮肤溃烂，家兔尖叫、口吐白沫，最终死亡。4.4.2伪狂犬病毒感染阴性：接种家免仍健活，判为阴性。5血清中和试验
5.1试验材料
0.25%胰酶（胰蛋白酶250mg加人100ml.汉克氏（Hanks）液中，充分溶解后，过滤除菌，--20C保存）,PK-15细胞；伪狂犬病阳性血清、阴性血清、伪狂犬病标准弱毒株；96孔细胞培养板。.
5.2操作步骤
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5.2.1病毒半数组织培养感染量（TCID5）的测定5.2.7.1病毒培养和收获：将伪狂犬病毒标准毒株接种于长成单层的PK15细胞，接种量为培养液的十分之一,37C培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。5.2.1.2病毒的滴定：用DMEM培养液将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即101、102..·每个稀释度取100μL加人96孔细胞培养板中，随后加经0.25%胰蛋白酶消化的PK-15细胞悬液100μL（细胞含量以105个/mL左右为宜）.每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照。置37C5%二氧化碳培养箱中甲。
5.2.1.3TCIID5o计算：逐日观察细胞病变和对照,共观察 3d～4 d天，并记录细胞病变孔数。按照Reed-Muench法计算病毒的TCIDs［见附录E（提示的附录）]。5.2.2 中和试验
5.2.2.1血清的处理：将无菌采集的待检血清置56C水浴灭活30min。5.2.2.2血清的稀释：在细胞培养板各孔中加入50μLDMEM培养液，随后在第1孔中加人待检血清50μl.混合后，用微量移液器取出50μL，加到第2孔中，混勾后取出50ul再加人第3孔中，依此类推，直至第10孔（将混合液弃去50μL），血清稀释度即为1：2、1：4、1：8.1：1024，每份待检血清稀释度作3个重复。
5.2.2.3加人病毒：将50ul.含200个TCI1>5o的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37C作用1h。5.2.2.4每血清孔中加人100μl.经胰蛋白酶消化分散的PK-15细胞悬液（细胞含量以105个/ml.左右为宜)。
5.2.2.5设立.对照组
5.2.2.5.1病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将200TCID50/50mL病毒液作1、10、100、1000倍稀释，每个稀释度作4孔，每孔加100uL病毒液，然后每孔100μLPK-15细胞悬液。5.2.2.5.2阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照。5.2.2.6结果观察：逐日观察，记录病变和非病变孔数，共观察7天。病毒回归试验中0.1TCIDso应不引起细胞病变，而100TCIDso应引起细胞病变，阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。5.2.3计算抗体中和效价
观察后确定能对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算抗体中和效价。如抗体效价为1：2及1：2以.上，则判为伪狂犬病抗体阳性。6酶联免疫吸附试验
6.1试验材料
抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清；底物邻苯二胺-过氧化氢（OPD-H2O，)溶液，抗原包被液、封闭液、冲洗液、终止液配制方法见附录C（标准的附录），酶标反应板。6.2操作步骤
6.2.1包被
用包被液（见附录C中C2)将抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内，每孔100μl，37℃作用1h后置4（冰箱过夜。
6.2.2洗涤
弃去孔内液体，用冲洗液（见附录C啡Ci）洗3次，每次3min，用圾水纸拍干。6.2.3封闭
各孔加人封闭液（见附录C中C3)100μL.37C作用1h。按6.2.2步骤洗涤。6.2.4加人待检血清和阴性、阳性血清对照157
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待检血清经56C:30min灭活后，用冲洗液作1：40稀释，加入抗原孔中，每孔100μI；同时将阴性血清对照和阳性血清对照各加人三个抗原孔中，分别记为A，A，A：和A，A，，A。孔。37C作用1h，重复6.2.2步骤。
6.2.5加入酶标抗体
用冲洗液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入100μL，37C作用1h，重复6.2.2步骤。6.2.6加人底物邻苯二胺-过氧化氢（OPD-H2O）（见附录C中C4)每孔100μl，室温避光显色25min。6.2.7终止反应
每孔加人50μL终止液（见附录C中C5)终止反应。6.2.8测定透光值(O)D)值
在酶联免疫检测仪上于490nm波长处测定光吸收值。6.2.9结果的判定
6.2.9.1阴性对照光吸收值（)D)3孔(A)、A2、A)的平均值（NC)按式（1)计算：NC,= A,OD A.OD.o + A,ODag
6.2.9.2阳性对照()D3孔（A4、A5、A)平均值（PC）按式（2)计算：PC.= A,OD.o + A.ODo ± A.ODa3
6.2.9.3血清检测值与阳性对照血清检测值之比(S/P)值按式(3)计算：样品 A490— NCx
PC- NC,
如S/P≥0.5，则判为抗体阳性；如S/P<0.5，则判为抗体阴性。7胶乳凝集试验
7.1试验材料
.（1)
伪狂犬病胶乳凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清，稀释液配制方法见附录D(标准的附录）。7.2操作步骤
7.2.1对照试验
取等量的胶乳凝集试验抗原（约20μL.)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片上混合，如分别出现如下判定标准中的不凝集和等于或高于50%凝集，则对照组成立，可进行待检血清的检测。7.2.2待检血清处理
待检血清不须热灭活或其他方式的灭活处理。待检血清的检测：将待检血清用稀释液（见附录D)作倍比稀释后，各取15μL与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在3min～5min内观察结果。7.2.3判定标准
可能出现以下几种凝集结果，即：100%凝集：混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘；75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集颗粒；50%凝集：凝集颗粒较细，液滴略浑浊；25%凝集：有少量凝集颗粒，混合液浑浊；0凝集：无凝集颗粒出现，混合液呈乳白色均匀一致的浑浊。7.2.4结果的判定
以出现50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价，其值1：2判为伪狂犬病抗体阳158
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性，否则判为抗体阴性。如为阴性，可用血清中和试验或酶联免疫吸附试验进-一步检测，可能出现以下三种结果：
如为阴性，则判为伪狂犬病抗体阴性；如为可疑，建议在间隔2周后再检测，如这三种方法均为阴性或可疑，判为阴性；如这三种方法中任何一种方法为阳性，则判为阳性；如中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性，均可判为伪狂犬病抗体阳性。159
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附录A
（标推的附录）
DMEM(高糖)培养液的配制
量取去离子水950ml，置于.定的容器中。A1
A2将DMEM粉剂10g加于15℃～30C的去离子水中，边加边搅拌。A3每1000ml.培养液加3.7g碳酸氢钠（NaHCO，）。A4加水至1000ml,用1mol/L(氢氧化钠）(NaOH)或盐酸(HCI)将培养液pH值调至低于pH6.9~7.0,在过滤之前应盖紧容器瓶塞。A5立即用孔径为0.22um的微孔滤膜正压过滤除菌，4C冰箱保存备用。附录B
(标准的附录）
聚合酶链反应溶液的配制
B1TEN 缓冲液
氯化钙(CaCl,）
三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl)(pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）三蒸水
B2溴化乙锭溶液
溴化乙锭
11. 00 mg(1 mmol/1.)
1 210. 00 mg(10 mmol/L)
372. 00 mg(1. 0 mmol/1.)
1 000 m/L.
三蒸水
磁力搅拌数小时以确保其溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。注：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。B3蛋由酶K（20mg/ml.)（贮存液）三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）乙.胺四乙酸(EDTA）
1. 2 mg(0. 01 mmol/L)
1. 86 mg(0. 005 mmol/1.)
三蒸水
加人蛋自酶K，使成为20mg/ml..即为贮存液。使用浓度为50μg/mL。B410%+二烷基硫酸钠(SDS)溶液的配制在90mL水中溶解10g电泳级十二烷基硫酸钠，加热至68C助溶，加人浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至100mL，分装备用。附录C
（标准的附录）
酶联免疫吸附试验溶液的配制
C1冲洗液
含0.05%叶温-20(Tween-20)pH7.4的磷酸盐缓冲液。将下列试剂按次序加入1000 ml.体积的容器中，充分溶解即成。160
氯化钠(N＆CI）
戴化钾（KCD)
磷酸氢二钠(Na2HPO,·12H,O)
磷酸二氢钾（KHPO）
杜温-20(Tween-20)
加蒸馏水至
C2抗原包被液
0.025mo1/1..pH9.6碳酸盐缓冲液。碳酸钠（NaCO，）
碳酸氢钠（NaHCO，）
蒸馏水
C3封闭液
冲洗液
牛血清自蛋自（BSA）
GB/T 18641-2002
1000mL
1000 mL
C4底物溶液邻苯二胺-过氧化氢（OPD-H2O2）C4.10.1mo1/LpHS.0磷酸盐-柠橼酸盐缓神液将下列试剂按次序加人1000mL体积的容器中，充分溶解即成。磷酸氢二钠（NazHP0,·12HO)
柠檬酸
蒸馏水
C4.2底物溶液
0.1mol/1.pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液邻苯二胺（OPD)bzxZ.net
30%过氧化氢(H,0,）
此液对光敏感，应避免强光直射。现配现用。C5终止液
2 mol/1. 硫酸(H2S)
硫酸(HzSO,)
燕馏水
1000mL
100 ml
0. 15 ml.
附录D
（标准的附录）
盘清稀释液
(0.1moI/LpH7.4磷酸盐缓冲液）将下列试剂按次序加人1000mL体积的容器中：氟化钠（NaCl）
磷酸氢二钠(NaxHPO,·12H2O)
磷酸二氢钾（KH.PO）
氟化钾（KC1）
加双蒸馏水至
1000ml
混匀届，充分溶解，最后加人叠氮钠(NaN，）防腐，其终浓度为万分之一161
举例说明：
病毒稀释度
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附录E
（提示的附录）
病毒半数组织培养感染量TCID5o的计算（按Reed-Muench法）
细胞病变
出现细胞
病变孔数
不出现细胞
病变孔数
累计孔数
不出现
细胞病变
细胞病变
细胞孔数
出现细胞病变
百分比/%
(51/51)100
(43/43)100
（35/35)100
(27/27)100
(19/19)100
(11/13)84.6
(5/11)45.4
(1/14)7.1
从表E1可见该病毒的TCID5在10-6（84.6%）和10（45.4%）之间，首先按式（E1)计算距离比：高于50%病变百分数—50
距离比
高于50%病变百分数低宇50%病变百分数--1gTCID5n一高于50%稀释度对数+距离比×稀释度对数代人公式：距离比一
84.6—50
84.6-45.4
1gTCIDs。=--6+0.88×(—1)=--6.88所以:TCID50= 10 6 88 /0. 1 mL.(E1)
由于病毒的稀释倍数是10-1倍，其稀释倍数的对数是（-1），因此可将上式获得的距离比（0.88)加引起细胞病变孔数高于细胞培养孔数50%的病毒稀释度的对数（6)上，因此该病毒的TCIID5.应是10-6.8 /0. 1 ml.
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