【国家标准(GB)】 动物布鲁氏菌病诊断技术

GB/T18646-2002
布鲁氏菌病简称布病)是由布鲁氏菌属细菌致人畜共患的传染病变态反应性疾病，世界范围性威胁人类健康和影响畜牧业发展。动物布病主要由羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌感染羊、牛和猪等动物呈急性或慢性经过。另外，是人布病的主要传染来源。其临床主要特征是母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织（如睾丸、关节）的炎症。世界动物卫生组织[World Organization for AnimalHealth（英），OfficeIntentionaldes Epizootic（法），OIE7将布病列为B类重要传染病，中华人民共和国传染病防治法将布病列为乙类传染病。为确诊动物布病要尽可能分离病原体，并鉴定其种和生物型，但方法复杂，需要的时间长，而且阳性检出率低。因此布病最常用的检疫技术是血清学诊断。目前我国常用的血清学方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验以及乳牛全乳环状试验。本标准的编制参考了OIE的《诊断试验和疫苗标准手册》有关章节，澳大利亚动物疾病诊断技术标推有关布病诊断部分和联合国粮食与农业组织（FAO)和世界卫生组织（WHO)联合布鲁氏菌病专家委员会推荐的《布鲁氏菌病实验室技术》（第三版）。本标准适用于对动物布病的检疫及监测。本标准的附录 A、附录B、附录 C、附录D是标准的附录,附录E、附录 F是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨善医研究所。本标准主要起草人：白文彬。
1范围
中华人民共和国国家标准
动物布鲁氏菌病诊断技术
Diagnostic techniques for animal brucellosis本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。GB/T 18646-2002
本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种、和猪种布病感染的家畜。
本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。2虎红平板凝集试验
2.1材料准备
2.1.1抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。2.1.2受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。2.1.3洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。2.1.4吸管或分装器，适于滴加0.03mL。2.1.5牙签或火柴杆，供搅拌用。2.2操作方法
2.2.1将玻璃板上各格标记受检清号，然后加相应血清0.03mL。2.2.2在受检血清旁滴加抗原0.03mL。2.2.3用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。2.2.4每次试验应设阴、阳性血清对照。2.3判定
2.3.1在阴、阳性血清对照成立的条件下,方可对被检血清进行判定。2.3.2受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（十），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（一）。
3乳牛布病全乳环状试验
3.1材料准备
3.7.1布病全乳环状抗原
由制标单位提供，按说明书使用。3.1.2乳样
3.1.2.1受检乳样须为新鲜的全乳。3.1.2.2采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器血中。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施
GB/T 18646—2002
3.1.2.3采集的乳样夏季时应于当日内检查，保存于2℃时，7d内仍可使用。3.2操作方法
3.2.1取乳样1ml，加于灭菌凝集试验管内。3.2.2取充分振荡混合均勾的全乳环状抗原1滴（约50μL）加人乳样中充分混勾。3.2.3置37C~~38℃水浴中60 min。3.2.4加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。3.3判定
标准分为：
a）强阳性反应（十十十），乳柱上层乳脂形成明显红色的环带，乳柱白色，临界分明；b）阳性反应（十十），乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色；c）弱阳性反应（十）,乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深；d）疑似反应（土），乳脂层的环带颜色不明显，与乳柱分界不清，乳柱不褪色；e）阴性反应（一），乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。4动物布病试管凝集试验
4.1材料准备
4.1.1稀释液
0.5%石炭酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。4.1.2抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。4.1.3凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱。4.2操作方法
4.2.1按常规方法采血分离血清。4.2.2运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9ml血清加1ml.5%石炭酸生理盐水（徐徐加人）防腐，也可用冷蔽方法运送血清。4.2.3受检血清的稀释
以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。4.2.3.1第一管标记检验编码后加1.15mL稀释液。4.2.3.2第2~4管各加人0.5mL稀释液。4.2.3.3然后用1mL吸管取被检血清0.1mL；加人第1管内，并混合均勾。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸人、吹出3～4次，充分混匀后以该吸管吸混合液0.25mL弃去。
4.2.3.4取0.5mL混合液加人第2管，用该吸管前述方法混合。4.2.3.5再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5ml4.2.3.6稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：50和1：100。4.2.3.7牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本-~致，差异是第一管加1.2mL稀释液和0.05ml被检血清。
4.2.3.8将0.5mL20倍稀释的抗原加人已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1：25、1：50、1：100和1：200,牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1：50、1：100、1：200和1:400
大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：50和1：100,猪、出、羊、绵羊和狗用125和1：50。
4.2.3.9置37℃～40℃温箱24h，取出检查并记录结果。190
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4.2.3.10每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即a）阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。b）阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同c)抗原对照：1：20稀释抗原液0.5mL，再加0.5ml.稀释液，观察抗原是否有自凝现象。4.3判定
4.3.1供判定参照比浊管制备方法见附录E（提示的附录）。4.3.2结果判定
4.3.2.1凝集反应程度分为：
参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读a）++++菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；b）+++菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；c）＋+菌体凝集显著，液体50%清亮；d）+凝集物有沉淀，液体25%清亮；e）—凝集物无沉淀，液体均匀混浊。4.3.2.2牛、马、鹿和骆驼1：100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1：50血清稀释，出现“十+”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。4.3.2.3牛、马、鹿、骆驼1：50血清稀释，猪、山羊、绵羊、狗1：25血清稀释，出现“十+”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应。可疑反应家畜经3周～4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必要时应配合补体结合试验和鉴别诊断，排除耶森氏菌交叉凝集反应。
5动物布病补体结合试验
5.1材料准备
5.1.1稀释液：0.85%生理盐水按常规方法配制。5.1.2绵羊红细胞悬液：采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤34次，最后一次以2000r/min离心沉淀10min，取下沉的红细胞泥，以稀释液配制成2.5%红细胞悬液。5.1.3抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素由制标单位提供，按说明书使用。5.1.4受检血清：收集和处理见附录A（标准的附录）。5.1.5溶血素：效价测定见附录B(标准的附录)。5.1.6补体：采集及其效价测定方法见附录C（标准的附录）。5.1.7抗原：效价测定见附录D（标准的附录）。5.2操作方法
5.2.1将1：10稀释经灭能（见附录A）的受检血清加人2支三分管内，每管0.5mL。5.2.2其中一管加工作量抗原0.5mL，另-管加稀释液0.5ml.。3上述2管均加工作量补体，每管0.5mL，振荡混匀。5.2.3
置37C38C水浴20min，取出放于室温（22℃～25℃）。5.2.41
每管各加2单位的溶血素0.5mL.和2.5%红细胞悬液0.5ml。充分振荡混匀。5.2.5
5.2.6再置37℃～38℃水浴20min，之后取出立即进行第一次判定。5.2.7每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照。主试验各要素添加量和顺序如表1。
血清加人量
稀释液
T.作量补体
二单位溶血素
2.5%红细胞
判定结果举例
5.3判定
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表 1布鲁氏菌病补体结合试验的主试验被检血清
阳性血清
37℃~38℃水浴20min
37℃~~38℃水浴20min
对照管
阴性血清
溶血素
5.3.1第次判定，要求不加抗原的阳性血清对照管，不加或加抗原的阴性血清对照管，抗原对照管呈完全溶血反应。
5.3.2初判后静置12h作第二次判定，第二次判定时要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血。5.3.3对照正确无误即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结果。标准比色管的制备方法见附录F（提示的附录）。5.3.4判定标准：
0~40%溶血判为阳性反应；
50%～90%溶面判为可疑反应；
100%溶血判为阴性反应。
牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。192
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附录A
（标准的附录）
受检血清的采集和处理
以常规方法采血和分离血清。用稀释液（5.1.1)将血清作1：10稀释，按表B1规定的水浴灭能。表A1各种被检动物血清的灭能温度和时间血清类别
驴、骤
黄牛、水牛、猪
鹿、骆驼
稀释溶血素
灭能温度/℃
附录B
（标准的附录）
溶血素效价测定
灭能时间/min
取0.2ml.含等量甘油防腐的溶血素，加9.8mL稀释液配成1：100的基础稀释液，按表B1方法作进一步稀释。
1：100稀释
溶血素
稀释液
溶血素稀释倍数
溶血素稀释法
按表B2加入各成分，而后37℃～38℃水浴20min。B3
溶血素效价
从水浴中取出，立即判定结果，用1：20补体0.5mL，在37℃~～38℃水浴20min，能使2.5%红细胞液 0.5 mL完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素。以表B2 为例,对照管均不溶血，1~~6管完全溶血，测定溶血素效价为3000倍。在主试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称二单位溶血素，则工作效价为1500倍稀释。效价测定后，2～3个月内可按此效价使用，不必重测。表B2溶血素效价测定表
稀释倍数
加人量
稀释液
10001500200025003000
4000450050005500
溶血素
对照管
稀释液
1：20补体
2.5%红细胞
结果(例)
C1补体采集
全部溶血
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表B2（完）
37℃~38C水浴20min
附录C
部分溶血
（标准的附录）
补体采集及其效价测定
溶血素
对照管
全部不溶血
稀释液
选择健康豚鼠3～5只，于使用前天早晨喂饲前或停食后6h从心脏采血，分离血清后混合保存干普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻干补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。C2补体效价测定
每次补体结合试验，应于当日测定补体效价。C2.1稀释补体并加各种成分
用稀释液配制1：20稀释补体，按表C1加人各种成分后，前后经37℃~38℃20min水浴2次，C2.2补体效价
经过2次水浴，在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。以表C1为例，第6管1：20稀释的补体0.25mL即为-一个补体单位。表C1
11：20补体
加人量
稀释液
加入量
江工作量抗原
加人量(不
加抗原量加
稀释液）
10倍稀释阳
(阴)性血清
补体效价测定
二单位
溶血素
2.5%红细
胞悬液
阳性血清
加抗原
阳性血清
结不加抗原
阴性血清
加抗原
阴性血清
不加抗原
+ ++++
++ ++++
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表C1（完）
振荡均匀后置37C~38℃水浴20min0.5
振荡均匀后置37C38℃水浴20min++++
原补体使用时应稀释倍数的计算+
原补体使用时应稀释倍数按式（C1)计算：原补体应稀释倍数=
补体稀释倍数
× 使用时每管加人量
测得效价
以表C1为例，按公式计算。.25
X0.5=40倍
即此例补体应作40倍稀释，每管加0.5ml.，即为一个补体单位。考虑补体性质不稳定，操作过程中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大10%左右，本例补体工作单位应作1：36稀释，每管使用0.5mL。
附录D
（标准的附录）
抗原效价测定
一般按照兽医制药厂产品说明书的效价使用。在初次使用或过久等其他原因需要测定时按下述步骤进行。
须取用两份阳性血清(分别为强阳性和弱阳性血清）和一份阴性血清来测定抗原效价。阴性血清和阳性血清稀释
用稀释液对阴性对照血清仅作1：10稀释，阳性血清稀释成1：10、1：25、1：50、1：75和1：100,5个稀释度。
D3稀释抗原
用稀释液将抗原稀释成1：10、1：50、1：75、1：100、1：150、1：200、1：300、1：400和1：500等稀释度。
D4按表D1加人各种成分，并经37C～38℃20min水浴2次。195
稀释倍数加人量
各种血清稀释度加人量
工作量补体
二个单位溶血素
2.5%红细胞
15记录抗原测定结果
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布鲁氏菌补体结合抗原效价测定4
37℃～38℃水浴 20 min
37℃~38℃水浴20 min
从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。例举范例如表D2。
抗原稀释倍数
血清稀释倍数
D6抗原效价
布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果(举例）10
补体对照
溶血素对照
抗原对阴性血清应完全溶血。对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。此内容来自标准下载网
在正式试验时，抗原的稀释度应比测定的效价浓25%。以表D2为例，其效价为1：150，正式试验时按1：112.5稀释使用。
（提示的附录）
试管凝集试验参照比独管的制备每次试验须配比独管，作为判定凝集反应程度的依据，先将20倍稀释抗原用等量稀释液作对倍稀释，然后按表E1配制比浊管。
1:40稀释抗原液
参照比浊管的配制
稀释液
记录标记
GB/T18646--2002
附录E
（提示的附录）
溶血程度的标准比色管的配制
配制方法如表F1，牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。表F1
溶血程度 /%
溶血溶液!
2.5%红细胞液
稀释液
判定符号
判定标准
标准比色管的配制方法及反应判定标准30
1试验中全溶血的试管内液体即为溶血溶液40
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