【国家标准(GB)】 饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的微生物学检验 Baird-parker琼脂培养基计数法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T23743—2009
饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的微生物学检验
Baird-Parker
琼脂培养基计数法
Microbiological examination of the enumeration of coagulase-positivestaphylococci in feeds-Technique using Baird-Parker agar medium(ISO 6888-1:1999/AMD.1:2003,Microbiology of food and animalfeeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of coagulase-positivestaphylococci (Staphylococcus aureus and other species)-Part 1:Technique using Baird-Parker agar medium;Amendment l:Inclusion of precision data, MOD)2009-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-09-01实施
中华人民共和国
国家标雅
饲料中凝固酶阳性葡萄球菡的微生物学检验
Baird-Parker
琼脂培养基计数法
CB/T23743--2009
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北京复兴门外三里河北街16号
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2009年7月第
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2009年？月第一次印刷
书号：155066-1-38180
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GB/T 23743--2009
本标准修改采用IS0）6888-1：1999/AMD.1：2003《食品和料微生物学固酶阳性葡荷球菌（金黄色葡荷球菌及其他种）的平行计数方法第1部分：Baird-Parker琼脂培养基法修订1：包含精密度》(英文版），
本标准根据ISO6888-1:1999/AMD.1：2003重新起草。除删除了前言和参考文献外，本标准的顺序编号与IS06888-1：1999/AMD,1：2003先全一样。ISO 6888 的三个部分是平行的三个方法,本标准只舰定了Baird-Parkcr 琼脂培养基法。考虑到本标准的适用范围和我国对标准编写的具体要求，在采用1S06888-1:1999/AMD.1:2003时，本标准作了一些编辑性修改。由于[SC)6888-1:1999/AMD.1：20U3的范围是食品和饲料，本标删除了仅涉及食品的部分内容。有关技术性差异已编入正文中并在它们所泌及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录A中给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。为了便于使用，对于IS06888-1:1999/AMD.1:2003还作了下列编辑性修改：a）“本国际标雅”一改为“本标准”；b）“稀释液和培养基”中的表格改为文字措述；c）用小数点“，”代替作为小数点的“，”，d）正文中的公式增加序号。
本标推的附录A为资料性附录。
本标准由会国饲料工业标推化技术委员会（SAC/TC76>提出并归口，本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）
本标雁主婴起草人：饶正华、李丽蓓、马东霞、张苏、苏晓鸥。科
1范围
饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的微生物学检验Baird-Parker
琼脂培养基计数法
GB/T23743-2009
本标准规定厂凝固酶阳性葡萄球菌在周体培养基（Baird-Parker培养基）上、36℃十1C好氧条件下培养后进行菌落计数的技术要求。本标准适用于饲料中凝固酶阳性葡萄球荫的检测。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于术标推，然而，鼓励根据本标难达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标推GB/T 4789.1食品卫生微生物学检验总则GB/T14699.1饲料采样(GI3/T14699.1—2005,ISO6497.2002,IDT)GB/T20195动物何料试样的制备（GB/T20195—2006,IS()64981998,IDT）ISO5725-2测试方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测试方法重复性和可再现性的基本方法
IS016140食品和动物饲料微生物学替代方法确认草案3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
凝固酶阳性葡萄球菌
coagulase-pasitive staphyloecci在本标准规定的检验条件下，在选择性固体培养基中培养可形成典型或/和非典型菌落月啦浆凝固酶试验为阳性的一群细菌。
凝固酶阳性葡萄球菌的计数enumeration of coagalase-positive staphylococci按本标准规定的方法,每案升或每克试样中凝固阳性葡葡球菌的数量。4原理
4.1用表面接种法在固休选择性培养基上进行定量接种，同时接种两个平血。液体样品真接接种，其他样品需用1：10稀释液接种。
在其他稀释度，同上法用稀释液接种。每个稀释度接种两个平血。4.2培养血在36℃±1℃好氧培养，在培养24h和48h时均要进行检查。4.3选择合适的稀释度水平，数血中生长的菌落数，计算每克（每毫升）样品中含有凝固阳性葡萄球菌的数量。
5稀释液和培养基
5.1总则
除非另有说明，在分析中仪使用确认为分析纯的试剂，实验究用水采用蒸馅水或去离子水或相当纯GB/T 23743—2009
度的水。
5.2稀释液
生理盐水：
氯化钠
1000mL
溶解后，分装到加有玻璃珠的锥形瓶内，每瓶225mL，121℃灭菌15min。5.3Baird-Parker琼脂培养基
注：可以使用商品培养基。使用时，严格按照川说即操作。5.3.1基础培养基
5.3.1.1成分
胰蛋白陈
酵母膏
丙酮酸钠
L-甘氨酸
氯化锂
5.3.1.2制备
12～22g
终体积为1 000 m1.
将上述成分煮沸溶解，商品基础培养基则按使用说明配制。必要时饺正P，使培养基灭菌后在25℃下pH为7.2士U.2。然后分装100mL到三角瓶或其他合适的容器中。121℃灭菌15min。5.3.2溶液
5.3.2.1亚碲酸钾溶液
5.3,2. 1.1成分
亚碲酸钾\（KzTeO,）
5. 3. 2. 1.2制备
稍微加热，便亚碲酸钾在水中完溶解。1.0g
亚碲酸钾应当是易溶的，如果在水中有白色不溶物，此试剂不可再用。用0.22μm的滤膜过滤除菌。
此溶液在3℃±2℃最多可保存.个月溶腋中形成白色沉淀时，应弃之不用，5. 3. 2.2卵黄乳液
浓度约为20%或遵照厂家规定。
注：可使用商品培券基。
取外壳完好的新鲜鸡蛋，用刷于蘸液体清洁剂刷洗蛋壳，再在流水中冲洗。然后将它们浸入70%酒精30s消毒后风干或用酒精喷酒之上，采用火焰炎菌。在无菌条件下，打被鸡蛋，不断啵出卵黄，从而把蛋白和卵黄分开。将卵黄放入火菌三角瓶巾，入四倍体积的水，充分镜匀。17℃水浴中加热2h，然后置于3℃士2℃下保持18h～24h以形成沉淀。无菌操作，将上清液转人另一灭菌三角瓶中。1琼脂的添加量取决于凝胶的强度2建议在使用之前,检查用于本试验的亚确酸钾的有效性(见 5.3. 2. 1.2)。此液在3℃±2℃最多可保存72h
5.3.2.3磺胺二甲嘧啶溶液
注：此溶液仅在试样中怀疑有变形杆菌时用。5.3.2.3. 1成分
磺胺二甲啶
氢氰化钠溶液，c(Na0II)=0.1mol/1水
GR/T 23743—2009
5.3.2.3.2制备
将胺二甲嘧啶溶解于氢氧化钠（NaOH)溶液中。用水稀释到100mL，用0.22μm的滤膜过滤除菌。
此溶液在3℃士2℃最多可保存-个月。5.3. 3完全培养基
5.3.3.1.成分
基础培养基（5.3.1)
亚碲酸钾溶液(5.3.2.1)
卵黄乳液（5.3.2.2)
磺胺二甲嘧啶(5.3.2.3)（必要时加入）5.3.3.2制备
熔化基础培养基，然后在水浴中凉至约47℃。100 mL
将亚碲酸钾和磺胺.甲嘧啶溶液（试样中怀疑有变形杆菌时加人）水浴加热至47℃左右，无菌操作加入到基础培养基中，混合均勾，5.3.4琼脂平板制备
将合适量的完全培养基倒入平Ⅲ中，使平匪内琼脂厚度约为4mm，然后让其凝固。这些平板干燥之前，可在3℃±2℃保存24h。注：使用商品培养基制备平板时，应注意厂家说明书中的保质期使用平板前，应在25℃～50℃的干媒箱中倒置十燥，直到培养基表面没有小滴水珠出现为止，5.4.脑心浸液肉汤
5.4.1成分
动物组织消化汤
脱水牛脑浸液
脱水牛心浸液
葡萄糖
氯化钠
磷酸氢一钠(NazHPO)
5.4.2制备
将完全培养基溶于水中，必要时加热10.0g
1 000 mL
校正pH值，使培养基灭菌后在25℃时pH为7.1士0.2。将培养基定展转移5ml.~10ml.到试管或合适容量的瓶中。121 ℃炭菌 15 mi。
5.5兔血浆
使用商家脱水免血浆并根据商品说明进行新水化。若没有脱水血浆，叮用三倍体积的灭菌水对一倍体积的新鲜灭菌免血浆进行稀释。3
GB/T 23743—2009
若柠檬酸钾或柠檬酸钠被用作血浆抗凝血剂，加0.1%EDTA到重新水化或稀释的血浆中。若无厂家规定，经重新水化和稀释的血浆应立即使用，使用前，分别用凝固酶阳性和阴性葡萄球菌对血浆进行验证。6仪器与玻璃器血
注：如果有相配的规格，可用一次性仪器代替可承复使用的破璃仪器。常规微生物室用仪器，见GB3/T4789.1。他如下：6.1干热及湿热灭菌器。
6.2 培养箱:36 ℃±1 ℃。
6.3T燥箱：温度范围为25℃±1℃到50℃士1℃之间。6.4水浴锅：47℃±2℃。
6.5试管、三角瓶和带螺憎的瓶子，6.6灭菌平：直径为90tnm或140mm。6.7接种针和移液管。
6.8刻度管，容积分别为1ml.、2mL和10ml.,最小分刻度分别为0.1mL.0.1mL0.1ml，6.9刮铲：需灭菌，由玻璃或塑料制成6. 10PH计:要求此 p-仪在25 ℃最小检测单位为 0. 01。测定时 pII精确到士0. 1 个单位。7采样
实验室样品真实，具有代表性、在运输和贮存过程中设有发生损失或改变是非常重要的。在采样过程中，采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品包装为袋、瓶和装者，就取光整的米开封的。样品是固体粉末，应边取边混和；是流体的，通过振挪即可混勾。样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将试样于0℃～5℃中保存（如冰壶）。！采样数量和方式接GB/F14699.1执行，8试样的制备
按照GB/T20195的规定制备试样（制备T具应是灭菌的），在密闭瓶中低温保存。9操作步骤
9.11：10稀释液和更高稀释液的制备以光菌操作将经过充分混勾的试样25g（或25mL)放入含有225mI.灭菌生理盐水的灭菌瓶内配成10-1释液。若需配制10-可取10稀释液1ml加人劑9mL无菌生理盐水试管中，更高稀释度可按此方法操作。
9.2接种
9.2.」用灭菌移液管将0.1mI.试样原液（液态样）或10-1稀释液（固态样）分别转人两个脂平板中必要时做10-\或做更高适置稀释度9.2.2对含凝固酶性葡萄球菌量较少的样品，可增加按种最至1.0mL接种方式用表面接种，涂在一个尺的平血（110mm)或二个小的平Ⅲ（90mm）上，=个小的平血的接种量分别为0.3ml、0.3mL。0.4 ml..
9.2.3用刮铲在晾脂平板表面接种时，应仔细而迅速，尽量不要接触平血边缘。盖上盖差，在密温下保持15min，使平板下燥。
9.3培养
将9.2.3中接种的平板于36℃±1℃培养箱中培养24h±2h，观察后，继续塔养24hi2h，！9. 4平板的选择与解释
GB/T 23743--2009
9.4.1培养24h12h后，在平板底部标F典型菌落的位置。将所有的平板在36℃+1℃继续培养24 h12h，标记新出现的典型菌落。同时也标记所有不典型的菌落。仅仅挑选同-稀释度中、两个乎行中菌落数在最多300个（含有150个典型或不典型菌落）最少15个的平板用来计数。若一个平板中只有典型（或不典型）菌落时，通常挑选5个典型（或不典型）菌落做鉴定，若平板中既有典型又有不典塑菌落时，应各选5个做鉴定。如果液态样原液或固态样10-1稀释度的平板上菌落数小于15个，按9.4.3和10.2对菌落数进行计算。
注1.典型菌落呈黑色或灰色，光滑，起，菌落直径在培养24h后为1mm~1.5mm，培养48h后为1.IL~2.5mm，菌落周围为一透明带，也可能部分是不透明的。在培养至少24h后，透明带可能会表现为乳白色的圈。
注2，非典型菌著与典型菌落大小剂当，可能会表现出如下形态之一光滑，黑色，具有或不具有狭窄的白色边缘，透明带不显现或者刚刷可见，乳白色的阖不显现或者很难观察；
没有透明带的灰荣落。
非典型菌落主要由来自牛奶、虾、杂碎制品中污染的凝固酵阳性葡葡球菌产生，其他制品的污染则比较少见，注3：平板上生长的其他菌落可能并未表现出注1和注2中所措述的典型或非典型的形态，可把它们当作背最菌群。
9.4.2如果接种量为1.0ml.(9.2.2）.涂在三个平乎板上（9.2.2），把这些平板当作一个进行随厉的计数和鉴定，
9.4.3若凝固醛阳性菌数小于15个，进行估计时，应保留所有典型和非典型菌落。挑取所有的菌落进行确证。
9.5确证(凝固酶试验)
将挑取的菌落用灭菌接种针接种至脑心浸液肉汤中，在36℃J.1%培养24h士2h。无菌操作，将每个培养液接种0.1mL至含0.3ml（除非家规定用其他量）免血浆的灭菌溶血管中,36℃1 ℃培养 24 h+2 h。
培养4h～6h后，倾斜试管，检查血浆是否凝结，如果没有凝结，应培养24h或按厂家规定的时间进行检查，
若凝块体积超过原液体积的·-半，则可认为凝固酶试验阳性。阴性对照：加0.1mL灭菌脑心浸液肉汤到定量免血浆中，不接种，培养。对照血浆应呈现出无凝块。
注：本标准测定的忌凝固酶阳性葡萄球菌，但必须认认划，有些金黄色葡萄球菌的菌株凝固酶阳性反应较弱雨很难区分，带要补充进行本标谁中未包据的试验，如溶葡菌酶灵敏性试验、产济血素试验，核酸醛热稳定性试验和占露婺产酸试验。
10结果表示
10.1总则
10.1.1每个平板中凝固酶阳性葡萄球菌的数量α的计算见式(1)：be
武中：
a-每个平板中凝固酶阳性葡萄球菌的数量，个b。凝固酶试验阳性的典型菌落数，个；A用来做凝固酶试验的典型荫落数，个GB/T 23743—2009
c。—平板中典型菌落总数,个;
一凝酶试验阳性的不典型菌落数，个；A一用来做凝固酶试验的不典型菌落数.个；平板中不典型菌落总数，个。
10.1.2试样中凝固酶阳性葡萄球菌的含量N的计算见式（2)：Zr
vx(n,+o.in,)xd
式中：
试样巾凝固嗨阳性葡萄球菌的含量，CFU/g；-所有挑选平板中含有的凝固酶阳性葡萄球菌菌落总数，个；V..—每个平血的接种鼠，mL
在挑选的平板第一个稀释度的平血数，个；·在挑选的平板第二个稀释度的平Ⅲ数，个；一挑选的第一个稀释度。
计算每克（每毫升）样品中含凝固酶阳性葡萄球菌的数量，按科学计数法报告结果，保留两位有效数字。
东例：
如接种量为0.1mL，第：个被选择的稀释度为10-1，两个平行中含典型菌落数分别为65、85，没有不典型菌落：第一个被选择的稀释度为10°，两个平行中含典型术落数分别为3、7，没有不典型菌落。其巾65个菌落中有个菌落被鉴定且均为固酶阳性，即a=65；85个菌落中有5个菌游被鉴定且3个为凝固酶阳性，即双=S1：3个菌落中有3个菌落被鉴定目均为凝固酶随性，即±—3;7个菌落中有5个菌落被鉴定且均为凝固游阳性，即a=7。N=5+= 57 272
0.22×10-
报告结巢即为;5. 7×10t。
10.2低菌数量的计算方法
10.2.1若液体样品或固体样品的10-稀释度的两个平皿中，含有鉴定的荫落数小于15,报告如下：a）被态样
武中：
每毫升试样含凝周酶阳性葡萄球菌的数量，CFU/mL；两个被选择平板中确定为凝固酶阳性葡萄球菌的总数，个；V-·每个板的接种量，mL.。
b）胤态样
式中：
V×2×d
-每克试样含凝固酶阳性葡萄球菌的数量，CFU/g；一两个被选择平板中确定为凝固酵阳性葡萄球菌的总数，个；V-每个乎板的接种量，mL；
稀释度，10-1。
（4）
10.2.2若试样（液态样）或10-1稀释液（周态样）的两个半硼无任何凝固酶阳性葡葡球菌生长且接种量为0.1nL，结果报告如下：
a）腋态样：每亳升含凝固嗨阳性葡萄球菌小丁10CFU；6
GB/T23743—2009
b）固态样:每克含凝固酶阳性葡萄球菌小于10/a CFU,式中d为稀释度10-1著液态样或固态样的10-稀释度的两个平血均无凝固酶阳性葡萄球菌生长且接种量为1mL，结果报告如下：
a）液态样：每毫升含凝固酶阳性葡萄球菌小于10 CFU;b）固态样：每克含凝固酶阳性葡萄球菌小于10/dCFU，式中d为稀释度10-1。11精密度
11.1总则
定量方法的精密度可如ISO5725-2中规定的.…-样，用重复性和再现性米表示。但是，ISO5725-2是基于平均值的计算方法，并不总是适台于微生物捡测，因为微生物并不总是表现出正态分布。因而，在ISO16140中，专门制定了适合于徽生物的对重复性和再现性的计算方法。这种统计法的优点在于对极值更不灵敏，因面可以保留对偏离值的统。统计者可以便用本章的内容。11.2重氨性
11.2.1重复性限
同-个操作者使用同·-仪器，对相间的试验基质用同…-种方法在尽可能短的间隔时间里重复做出的两个单独的测试结果（每克或每亳升中凝固酶阳性葡萄球菌数量的对数值）,绝对相差或者在正常范围内的两个结果中高值与低值的比值，应当不超过重复性限（r)的5%。11.2.2总体值
常情况下，检测饲料样品时,是用下而的重复性限(t)，r值通常适用于所有的基质：--0.28（表示检验结果对数值的绝对相差)；r一1.9裴示在正常范围内的两个检验结巢中高值与概值的比值）。示例：观察到饲料中凝固醇阳性葡莓球菌的第一个检测结果为10000CFU/g成1.0X10*CFU/g，按重复性要求，高值与低值的比例不超过1.9，因此，第二个结果应在5263(-10000/19)CFU/区～19000（=10000X×1.9)CFU/g之间。
11.3再现性
t1.3.1再现性限
不同的操作者在不同的实验室用不同的仪器，对相同的试验基质用同种方法做出的两个单独的测试结果（每克或每毫升中凝固酶阳性葡萄球菌数量的对数值），绝对相差或者作正常范围内的两个结果中高值与低值的比值，应当不超过再现性限(R)的5%。11.3.2总体值
通常情况下，检测饲料样品时，是用下面的再现性限(R),R值通常适用士所有的基质：R=0. 43(表示检验结果对数值的绝对相差);R=2.7(表示在正常范围内的两个检验结果中高值与低值的比值）。示例1:第一个实验室得到焖料中凝固酶阳性猫萄球菌的检测结果为1.0×101CFU/g,按再现性要求，第一个检测结果与第二个实验室结果的比不超过2.7，因此，第二个实验室凝固阳性葡萄球菌的检测值应在3.7×10（=1.0×10°/2.7)CFU/g~2.7×10(=1.0×10×2.7)CFU/g之间示例2:实验室想知道符合预设限(如105或以10为底对数为5)的最大水乎，应用R值(取对数)X0.59。结果的对数差是0.25（0.43×0.59），结果比值在100.25。回此，结果高于lng5.25（—1ogt5+log1s0.25)或1.8×10%并不表明不符合此限。0.59这个因了反映在单边95%置信度下检测是否超出了再现性限，0,59因于由下面的公式获得：0.59-1.96×/2
12检验报告
检验报告应包括光整的样品鉴定所需的全部详细内容。检验报告应包括采样方法、检验方法和检验结果，它应阐明在标准中规定的条或可供选择的条件，以及所有可能影响结果的细节。科
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附录A
（资料性附录）
本标准与ISO 6888-1:1999/AMD.1:2003的技术性差异及其原因表A.1给出了本标准与ISO6888-1：1999/AMD.1:2003的技术性差异及原因的.-览表表 A.1本标准与 IS0 6888-1:1999/AMD.1:2003技术性差异及原因本标准的章条编号
附录A
技术性差异
除IS() 6888-1标范围中“适用于人类消费品”。本标准范围只针对间料HCB/T4789.1.CB/T14699.1和GB/T20195和文字描述替换ISO6887-1和1SO7218。将减度定为 36 ℃上1℃,同时删除脚注。增加了更商稀释度的配制方法。增加了对三个小的平血上接种虽的规定。增加了对低菌数的数虽规定。
增加“注”。
删去对胶避食品的特殊规定。下载标准就来标准下载网
删除ISO6888-1标准片的附录A。按规定增加我国标准的附录A。
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打印门期：2009年10月14日
为了与我国的标准相--致,并方使标准使川者查询。
行统一,便于实验人员操作。
于实验人员操作。
便于实验人员操作。
便于实验人员操作。
原国际标准前言中的内容，出较意要。饲料项常没有胶囊状的,
TSO 6888-1 附录 A 中实验室间试验结果针对干酪、肉、蛋粉等食品类,与饲料无关。
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