【国家标准(GB)】 饲料中4种巴比妥类药物的测定

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 23741—2009
饲料中4种巴比妥类药物的测定
Determination of four kinds of barbiturates in feeds2009-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-09-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提山并归口，本标准主要起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）。本标准主要起草人：李俊玲、李会荣、强莉、刘继明、门晓冬、夺宏、杨志强。http：/
GB/T23741—2009
1范围
饲料中4种巴比晏类药物的测定
GB/T 23741--2009
本标雅规定了饲料中巴比妥，苹巴比要，异戊巴比要和司可凹比妥的高效腋相色谱测定方法和液相色谱-串联质谱测定法，
本标推适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定。高效液相色谱测定方法定量限为 1 mg/kg,液相色谱-串联质谱方法定量限为 0.05 mg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的晟新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682200B，1SQ3696：1987.MOD)GB/T 14699.1料采样(GB/T 14699.1—2005,ISO 6497:2002,IDT)GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006,TSO6198:1998ID)T）3方法原理
试样中的4种巴比要类药物用三氯甲烷提取，过滤，滤液吹于后溶解过固相萃取小柱净化，洗脱液蒸干后用中醇水溶解，在高效液相色谱仪上分离、测定，或在高效液相色谱-串联质谱仪上测，外标法定量。
4试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合（B/T6682一级水的规定。4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙睛：色谱纯。
4.3三氯甲烷。
4.4一氯甲烧。
4. 52%甲醇水溶液:取 2 mL 中醇与 98 mL水混合。4.6甲醇水溶液：1十1.
4.7乙睛水溶液：30+70。
4.8磷酸盐缓冲液：c(NaHPO41NaHPO.2H.0)=0.1mmol/L,pH-6.0。称取11.2g的无水磷酸氢二钠（NaaHPO.），加水定容至.1000mL，播匀；另称取15.6g的磷酸二氢钠（NaII,PO，2H,0)，加水定容至1000ml，摇匀。取上述两种溶液按123一877的比例混勾即叫。4. 9流动相;甲醇1水=45+55.
4.10巴比要、米巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比要标准品：纯度99.0%。4.11标准账备液：准确称取比妥、苯巴比要、异成巴比要和司询巴比要标准品各25扭g，分别用用醇(4.1)溶解，定容至25mL，配成浓为1mg/mL的标准贮备液。2℃～8℃冷藏保存，有效期三个月。4.12混合标准中间液：准确移取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥贮备液（4.11)各5mL，用甲醇（1.1)定容至50mL，该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为100μg/ml.。2℃~-8℃冷保存，有效期-个月。GB/T 23741--2009
固相萃取小柱：亲水亲脂平衡固相萃取柱，3mL（60ng），4.13
滤膜：0.22μm。
滤纸：快速，12.5cm。
5仪器和设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.3天平：感量为0.0001g。
5.4氮吹仪。
5.5涡旋振荡器。
5. 6固相装最仪。
6试样制备
按GB/T14699.1采样。选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195规定，制备通过0.45 rram 实验筛的试样，
7试样处理
7.1提取
称取试料2（精确至0.0U01)于100mI.离心管中，准确加人25mL三氮甲烷（4.3），涡旋振荡2min，过滤。准确移取滤液15ml.于具塞试替中，40℃氮吹至干，加人磷酸盐缓冲液（4.8)3mL，涡旋溶解，备用，
7.2净化
周相萃取小柱分别用5 uL甲醇(4.1)、5 mL水,5mL磷酸盐缓冲液(4.8)活化。取.上述提液(7. 1)过柱，再分别用5 mL磷酸盐缓冲液(4.8)、5 ml. 甲醇水溶液(4. 5)淋洗,空气抽于 30 min,用10mL二氯甲烷(4.4)洗脱，收集洗脱液，40℃氮吹至+，准确移取1mL甲醇水溶液（4.6)溶解残泄过C.22um滤膜后待测。
8液相色谱测定
8. 1 液相色谱条件Www.bzxZ.net
色谱柱:Cs柱长 250 nrri,内径 4. 6 tnim,粒径 5μm,或其他效果等同的 C.柱。柱温：室温。
进样量：20μL
流动相：甲醇+水=4555。
检测器：紫外检测器或一极管阵列检测器。检测波长：215nm
流速：1.0ml/min。
8.2标准曲线的绘制
取混合标准中间液（4.12)适量逐步稀释，用甲醇（4.1）起容，配制成液度分别为0.5/mL，1.0g/mL、5.0μg/ml、10.0g/ml、20.0附g/L、50.0μg/mL的混合标雅工作液，浓度由低到高进样，根据峰面积和浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.1.8.3定量测定
试料溶液（7.2）上机测定，用单点或多点校证法进行定量。多点校准法定量，根据峰拍积的响应值，从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（c.）；单点定量，据样品峰面积的响应值与标准2
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溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（c，）。8. 4结果计算
试料中4种巴比姿类药物的含量xm，以质量分数计，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)计算Xa = nXV×VzX1 000
m ×Vi X1000
式中：
-试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（\g/mL)；加入提取液的总体积，单位为毫升(mL)；-氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积，单位为毫升(mL)；试料的质量，单位为克(g)：
-移取滤液的体积，单位为毫升（mL)。计算结果保留三位有效数字。
8.5重复性
在同一-实验室、出同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。液相色谱-串联质谱法（仲裁法）液相色谱条件
色谱柱：C柱长100mm，内径2.1tmm，粒径1.7μm，或其他效果等同的Ca柱；柱温：40℃，
进样量:5μL；
流动相：艺睛+水，梯度洗脱，见表1；裴1滋相色谱-串联质谱流动相梯度洗脱表时间/ain
流速:0. 1 mL/min。
质谱条件
离子源：电喷雾离子源：
扫描方式：负离了扫撕；
检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：1.0kV；
下爆气温度：350℃，
T燥气流速：10L/min；
募化气压力：0.241MPa(35psi）；水/%
乙晴/%
定性离子，定展离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2。3
日伙伴区
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被测物名称
巴比妥
茉巴比妥
异戊巴比妥
奇可国比娶
表24种巴比要类药物的定性、定量离子对及碰撞能量定性离子对
183.2>84.9
183.2140.1
231, 02>84. 9
231, 0>188. 1
225.2>84. 9
225. 2>182. 2
237.22-84. 9
237.2194.2
定量离子对
183.2>140. 1
231.0188.1
225. 2>182. 2
237.2>194. 2
9.3巴比要类药物定性、定量离子对及碰撞能量保留时间/
4种巴比要类药物定性、定量离广对没碰撞能量见表2。9.4标准曲线的绘制
毛细臂出凸端电压/
碰撞能草/
取混合标准中间液（4.12）适量逐步稀释，用乙睛水（4.7）稀释定容，配制成浓度分别为0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.050μg/ml..0.075μg/mL.0.100μg/mL0.200μg/mL的混合标准工作液，浓度由低到高进样，根据峰面积利浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱条件下标准样品图谱参见图A.2。
9.5试液准备
取7.2项下的待测液，根据药物的浓度用乙腈水溶液(4.7)适当稀释。9.6定性测定
根据试样中各种化合物的保留时间和特征选择离了定性，试样中待测物质的保留时间与混合标推品工作液中对应的保留时间偏差在2.5%之内，H样品谱图中各组分定性离了的相对离子丰度与浓度接近的标准品工作液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若相差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。表 3 定性确证时相对离子丰度的最大相差相对离子丰度
允许的最人相差
9.7定量测定
>10~20
以定量离子的色谱峰面积进行单点或多点校正定量。多点校准法定晟，根据峰面积的响应值，从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（c）；单点定最，根据样品峰面积的响应值与标雅溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓斑的乘积得到待测样中4种巴比妥奖药物的浓度（c）。9.8结果计算
试料中4种巴比妥类药物的含量X，以质量分数计，单位为毫克每干克（mg/kg），按式（2)计算：X# = eXVXVXV 1 000
m ×V, × V, x 1 o00
我中：
试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每旁升（ug/ml.）；Ca-.
加入提取液的总体积，单位为毫升（mL)；氮吹牟干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积，单位为毫升(mL)；(2)
V，.吸取7.2项下试液的体积，单位为毫升（mL)；T
试料的质量，单位为克（区）：移取滤液的体积，单位为毫升（ml)；V,
V、--吸取7.2项下试液定容的体积，单位为毫升（mIL.），计算结果保留三位有效数字。
9.9重复性
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在同实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于20%，以两次平行测定结果的算术乎均值为测定结果。http:/
nEonma
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附录A
（资料性附录）
4种巴比要类药物标准样品谱图
A.1图A.1给出了4种巴比妥类药物液相色谱图谱。mAi!
中国全营国限
图A.1.4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱A.2图A.2给出了4种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱。X10°TICMRM
MI(237.200 00>84.900 39)
MEM(237. 200 00 2 194. 199 221XI0%MRM(231. 000 00 >84. 900 39)MRM(231.000 00≥18B. 099 61)x10
X102MRM(225.20000>84.90039)
X10MRM(225.20000>182.199 22)MKM (183. 200 00>84. 900 39)X10
总子流色谱图：
：司可巴比妥定性离子：
可时巴比妥定量离子；
举巴比要定性离子；
苯已比妥定量离了；
异我巴比娶定性离子，
异成巴比要定量离子；
巴比妥定性离于，
巴比娶定量离子
MRM(183.200 002140. 099 61)
0.511.522.593.544.555.566.577.588.599.510/min
图A.24种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱图（MRM色谱图）（200ng/mL）合品伙伴网httn：
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打印期：2009年10月141
中华人民共和国
国家标滩
简料中4种巴比妥类药物的剃定
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开本880×12301/16印张0.75字数12千学2009 年7月第一版2009年:7月第一次印刷*
书号：155066：1-38178定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究
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