【国家标准(GB)】 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术

GB/T18637--2002
牛病毒性腹泻/粘膜病（bovineviraldiarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV)引起的牛的-种以粘膜发炎、糜烂，坏死和腹泻为特征的疾病。应用微量血清中和试验检查BVD/MD抗体，具有其特殊意义，它不仅可以定性，而且还可以定量，并从抗体量的动态变化中，可以判定病牛是以前感染过本病，还是现在正在感染过程中，从而为防治本病提供科学依据。
本标推的附录 A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准油中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国兽药监察所、农业部动物检疫所。本标准主要起草人：邵振华、郑志刚。127
中华人民共和国国家标准
牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术
Diagnostic techniques for bovine viral diarrhea /mucosal disease1范围
本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病（BVD/MD)的诊断技术要求。本标准适用于BVD/MD的流行病学调查和检疫。2定义
本标准采用下列定义。
细胞玻片
GB/T18637-2002
放置在莱顿氏（Leighton's）管或其他用作培养细胞的小瓶中，长有单层细胞的盖玻片。3BVD/MD病毒分离与鉴定
3.1材料准备
3.1.1阳性参照毒株为牛粘膜病病毒俄勒冈毒株（OregonC24V）。3.1.2BVD/MD荧光抗体(BVD/MD-FA)、阳性血清3.1.3荧光显微镜：采用蓝紫光为激发光的透射式或落射式荧光显微镜。3.1.4犊牛（或胎牛）血清：无BVD/MD抗体和无污染。3.1.5细胞培养瓶扁瓶、Leightons管、0.17mm厚度的盖玻片（1.0cm×3.8cm或0.8cm×2.4cm）,0.8mm～1.0mm厚的普通玻璃载片，带盖湿盒。3.1.6溶液配制：pH7.0~~7.20.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH9.0~9.50.5mol/1.碳酸缓冲甘油见附录A（标准的附录)。
3.1.7细胞培养液：见附录B(标准的附录）。3.1.8原代细胞培养物：见附录C(标准的附录）。3.2病毒分离
3.2.1样品的采集
3.2.1.1对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。3.2.1.2对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采血或鼻分泌物。3.2.1.3对流产、死胎，采胎儿的组织。3.2.1.4对怀疑为死于粘膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已发生白溶，可采扁桃体或淋巴结。3.2.2样品处理
3.2.2.1血液用常规方法分离血清。凝血块：冻融数次后，取析出的上清液（加入适量的双抗即青链霉素）。3. 2. 2. 2
3.2.2.3组织样品用含1000IU/ml.双抗的细胞培养液作1：10倍的乳剂，离心取上清液，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准128
2002-05-01实施
GB/T 18637---2002
3.2.2.4精液冻融3次（或超声波裂解处理），用细胞培养液作1：10倍稀释，离心取上清液。3.2.2.5鼻分泌物：用含1000IU（mg）/mL双抗的培养液4倍稀释后，离心取上清液。以上各样品处理后均需作无菌检验。3.2.3样品的接种培养
3.2.3.1将10mL牛睾丸原代细胞（见附录C)接种于小扁瓶，置37C静止培养。培养到细胞形成80%以上单层。
3.2.3.2取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.1~3.2.2.5的样品，每瓶接种样品1mL每份样品接种3瓶。
3.2.3.3置37C吸附2h～3h。
3.2.3.4吸附后，将样品倒去，加维持液［见附录B中B1，另加3%特牛血清（3.1.4）10mL置37C恒温培养。
3.2.3.5培养6d后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物。3.3样品分离物的病毒鉴定
3.3.1分离物的细胞玻片培养
3.3.1.1将1ml牛睾丸原代细胞悬液，接种于带盖玻片（3.1.5）的Leighton's管，置37C培养，至盖玻片上细胞生长成80%的单层。
3.3.1.2取3.3.1.1中4个Leighton's管，倒去培养液，每瓶接种3.2.3.5中样品分离细胞培养物1 mL。
3.3.1.3置37C吸附2h～3h。
3.3.1.4吸附后，加维持液1mL，置37C恒温培养3d。3.3.1.5取出细胞玻片.用磷酸盐缓冲液（见附录A中A1)轻轻漂洗，倾去液体，自然干燥。用纯丙酮室温固定10 min～15 min。
3.3.1.6取各组固定后的细胞玻片（样品组取半数，余者在必要时作抑制染色试验用），置湿盒内，细胞面向上，滴加BVD/MD-FA（3.1.2)，并使免疫荧光抗体（FA）铺满而又不溢出于细胞面。将湿盒盖盖严，置37C染色2h。随后取出，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，倾去液体。3.3.1.7封片：将细胞面向下，用碳酸盐缓冲甘油（见附录A中A2)封贴于载玻片上。3.3.2对照
3.3.2.1阳性参照组：取3.3.1.1中带有细胞玻片的Leighton's管2管，每管接种0.1ml.100TCID)50的0regonC24V(3.1.1),此后按3.3.1.3~～3.3.1.7方法操作。3.3.2.2阴性对照组：取3.3.1.1中带细胞玻片的Leighton's管2管，按3.3.1.5～3.3.1.7方法操作。
3.3.3镜检
3.3.3.1被BVD/MDV感染的细胞，在蓝紫光激发的荧光显微镜下，胞浆呈黄绿色的荧光，并常见有闪烁明亮黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。未感染细胞无荧光。3.3.3.2荧光观察记录：荧光在激发光照射下，随时间延长而明显减弱，因此在染色后，应尽快镜检及时记录，记录可分为：
a）（－)无荧光；
b）（十）荧光微弱，形态不清晰；c）（++)荧光较亮,形态清晰；
d）（→++++)荧光较强，明亮闪烁，形态清晰。3.3.4荧光抑制试验
1）双抗指青霉素（IU)和链霉素（μg）。129
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3.3.4.1取3.3.1.6中固定后余下的细胞玻片，滴加BVD/MDV的阳性血清（3.1.2），置37C作用1h后.用磷酸盐缓冲液充分洗涤3次。3.3.4.2此后按3.3.1.6～3.3.1.7中规定进行操作。3.3.4.3判定：在抑制试验中，荧光被BVD/MID的阳性班1清所抑制，则判定原样品分离物的荧光为BVD/MD病毒抗原特异荧光。
3.3.5终判定：当阴性对照为（一），阳性参照为（十十十）以上，抑制试验对照片荧光被抑制，被检组为3.3.3.2中c)和d)时判为分离病毒阳性；为3.3.3.2中b)者应重检，重检后仍为3.3.3.2中b)者，则判阳性；被检组为3.3.3.2中a者，判阴性。当阳性参照不出现特异荧光，为无结果，应予重检。4微量血清中和试验
4.1材料准备
4.1.1标准毒株OregonC24V。
4.1.2标准阳性血清、标准阴性血清。4.1.3细胞：可用犊牛原代肾细胞、睾丸细胞和鼻甲细胞（见附录C)或牛鼻甲细胞系（MDBK)细胞。4.1.4培养基
4.1.4.1稀释液营养液，pH7.0~~7.2，每毫升加100mg链霉素和100IU青霉素，按说明书配制。4.1.4.2生长液：营养液加10%犊牛血清（3.1.4)。4.1.4.3维持液：营养液加2%~~5%犊牛血清。4.1.5被检血清：无菌静脉采血，常规分离血清，56C灭活30min。4.1.6微量细胞培养板（简称微量板）96孔平底板。4.1.7加样器，单通道或多通道的可调加样器。4.2操作程序
4.2.1定量测定
4.2.1.1用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液（4.1.4.1)50μL。4.2.1.2用单通道加样器取50μL灭活的被检血清加于微量板的第一排孔中，每份样品加4个孔。4.2.1.3用多通道加样器（调至50uL）从第一排孔开始作连续倍比稀释，直至最后-个孔，并从最后孔中弃去50μl稀释物。
4.2.1.4用稀释液将标准毒株OregonC24V（4.1.1)稀释成含100TCID5/50μl的工作液。4.2.1.5用多通道加样器从第二排孔开始每孔加病毒工作液50uL，第一排孔中加50uL稀释液作为被检血清毒性对照
4.2.1.6将微量板盖严，置于37C5%二氧化碳培养箱中中和2h~3h。4.2.1.7将细胞悬液（见附录C)100μl.加到微量板各孔中，或将生长成良好单层的细胞用EI)IA~胰酶消化液消化分散后，用生长液（4.1.4.2)配制成含40万/mL的细胞悬液加到微量板的各孔中，每孔100μl
4.2.1.8按4.2.1.6中方法培养6d，从第四天开始观察结果，并于第6d作终判。4.2.1.9试验需作下列对照：
a）阳性血清（4.1.2)对照：2倍稀释血清50μL+50μL病毒工作液+100μl.细胞悬液。b）阴性血清（4.1.2)对照：2倍稀释血清50ul+50μL病毒工作液+100μL细胞悬液。c）正常细胞对照：细胞悬液100μ+维持液100μ。d）病毒用量滴定：将病毒工作液用稀释液作三次10倍递进稀释取：1）病毒.I作液100TCIDso/50μL：50μL+稀释液50μL+细胞悬液100μL2）10病毒T作液10TCIDso/50μL：50μL+稀释液50μl.+细胞悬液100μl；3）10*病毒作液1TCID5/50μl：50uL+稀释液50μl+细胞悬液100μL；130
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A）10\\病毒I作液0TCIDso/50μL：50μl.+稀释液50μL+细胞悬液100μl.。以1各对照均作4个孔。
4.2.2定性试验
4.2.2.1用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液40uL。4.2.2.2用单通道加样器取10l.灭活的被检血清加到微量板与血清编号相应的孔中，每份血清作4个孔。
4.2.2.3病毒工作液稀释方法同4.2.1.4。4.2.2.4用多通道加样器将病毒工.作液加到微量板的各孔中，每孔50αl。4.2.2.5以下操作按4.2.1.6~4.2.1.9规定进行。4.2.3双份血清测定
4.2.3.1双份被检班清取自同一动物，间隔21d，按4.1.5采集、处理4.2.3.2试验操作方法同4.2.1。4.3结果判定
试验后第4d开始观察结果，并于第6d作终判。当细胞对照孔内细胞单层生长良好，病毒用量在50TCIDa/50αL～500TCID/50μL范围之内阳性血清对照孔不出现细胞病变，阴性血清对照孔出现细胞病变，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，应重作，
4.3.1判定标准
4.3.1.1定鼠试验：每份血清同-稀释度的4个孔中有两个孔完全被保护，不出现细胞病变（CPE)时，该稀释度倒数即为该血清的抗体滴度。4.3.1.2定性试验：被检血清在1：5稀释时有2个或2个以上孔的细胞被完全保护，该血清即为阳性。
4.3.1.3双份血清测定：当相隔21d的第二份血清的滴度高于第一份血清两个或两个以上滴度，则证明该动物正在发病过程中。
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附桑A
(标准的附录）
溶液的配制
A1pH7.0~7.6 0. 01 mo1/L 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A1.10.2mol/磷酸缓冲液（PB)(母液）的配制见表A1。各种pH0.2mol/LPB（母液）的配制比例表（100mL母液）表A1
0.2mo1/1磷酸氢二钠（NazHPO,)ml.
0.2 mol/1.磷酸二氢钠(NaHzPO)）ml.
按所需pH值查表A1.按体积比例混合二液，即为0.2mol/1.母液。A1.20.01mo1/1磷酸盐缓冲液的配制：将母液用蒸馏水作20倍稀释，并按0.85%加入氟化钠即得。A2pH9.0~9.50.5mol/L碳酸盐缓冲甘油的配制A2.1pH9.0~9.50.5mol/l.碳酸盐缓冲液的配制见表A2。表A2pH9.0~9.50.5mol/L碳酸盐缓冲液pH
0. 5 mnl/L 碳酸氢钠(NaHCO,)
按表A2所列体积混合二液即可。0. 5 mol /L 碳酸钠(NazCO),)
A2.2pH9.0~9.5碳酸甘油的配制：碳酸盐缓冲液：甘油（中性）=1：9，混合即得。附录B
（标准的附录）
细胞培养液的制备
B1汉克氏（Hanks）源液（10倍原液）化钠（NaCI）
磷酸氢二钠(Na2HPO,·12HO)
氧化钾(KCI)
磷酸二氢钾（KHPO)
硫酸镁（MgSO47HO)
氟化钙（CaCl,）
双蒸馅水加至
500mL加1ml三氟甲烷充分振荡，4℃冰箱保存。Hanks液为Hanks原液稀释10倍。132
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Hanks 液1000 mL+4mL 酚红,68.94kPa灭菌10 min。B20.5%（乳汉液L-H液）bZxz.net
水解乳蛋白
69kPa灭菌10min，4C冰箱保存。1000mL
附录C
（标准的附录）
牛睾丸(或牛肾、鼻甲)原代细胞的制作C1选择健康初生牛，放血致死，无菌取睾丸或肾脏、鼻甲组织C2将组织（牛肾剪取皮质部），剪成1mm～2mm2小块组织，用含300IU/ml双抗的汉克氏液（见附录B中B1)漂洗2~3次，并漂去漂浮的碎渣组织，倒去液体。C3按组织重量的5倍，加人0.25%胰酶-Hanks液（pH 7.4~~7.8），置37C水浴中消化30min~~40 min。沉淀片刻,除去胰酶。
C4用汉克氏液洗2～3次后，加人适量营养液[含5%~～10%犊牛血清的乳汉液（见附录B中B2)吹打、分散已消化疏松的组织。用4层纱布滤过，制成约40万/mL.～70万/mL活细胞悬液备用。C5也可分装于培养瓶，培养成单层，保存于4'C备用。133
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