【国家标准(GB)】 狂犬病诊断技术

GB/T18639—2002
狂犬病(rabies)是由弹状病毒科狂犬病病毒引起的-一种人兽共患的急性接触性传染病。主要侵害中枢神经系统，引起狂暴不安和意识紊乱等症状，最后麻痹、衰竭而死。发病率不高，病死率几乎为百分之百。本病呈世界性分布，以亚溯最多发生。我国也不例外，近年来有增多的趋势。世界各国十分重视狂犬病的研究和检疫。世界动物卫生组织［World Organization for Animal Health（英）,OfficeInten-tionaldes Epizootic（法）,OIE］和我国已将其列为重点防制的二类动物疾病。狂犬病症状非常明显，却非十分特异，且无肉眼可见的特殊病变。狂犬病的确诊有赖于实验室的检查结果。但是，由于本病发病急，病程短，病死率高，使得实验室诊断通常以检查病毒抗原为主。例如，世界卫生组织（WH())已把基于病原鉴定的内基氏个体（negribodies）检查、免疫荧光试验和小鼠及细胞培养物感染试验，作为诊断狂犬病的定性方法并将其标准化。OIE予以采纳并向各成员国推荐使用。本标准是参照WHO和OIE推荐的这些方法，结合我国的研究成果和实际情况而制定的。本标准的实施，对提高狂犬病的诊断和检疫水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要作用。需要指出的是，内基氏小体检查和免疫荧光试验分别可能产生5%～10%和2%～5%的假阴性结果。因此，在进行上述两项检查的同时，应进行小鼠感染试验，即把这三项检查视为狂犬病诊断的二个必要程序。
本标准的附录A为标准的附录，附录 B为提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国人民解放军农牧大学。本标准主要起草人：宣华、向华。145
1范围
中华人民共和国国家标准
狂犬病诊断技术
Diagnostic techniques for rabies in animalsGB/T 18639.--2002
本标准规定了狂犬病内基氏小体（negri bodies）检查、免疫荧光试验、小鼠和细胞培养物感染试验的技术要求。
本标准适用于各种易感动物的狂犬病的诊断和检疫。2内基氏小体检查
2.1准备
2.1.1器材：胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具；骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解剖器具；切片机、染色缸等组织制片与染色器具；光学显微镜等。2.1.2标本保存液：10%（体积分数）福尔马林溶液，50%（体积分数）甘油生理盐水。2.1.3染色液：赛勒（Seller）氏染色液，曼（Mann）氏染色液，其配制方法见附录A（标准的附录）。2.1.4人身防护：见附录B（提示的附录）。2.2样品的采集和运送
2.2.1对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物（含实验感染小鼠），应在死亡后3h内（越早越好）由大脑海马回（Ammon氏角）、小脑皮质和延髓各切取1cm组织数块，放人灭菌玻璃瓶，再置于冰瓶内于24h内送达实验室。
2.2.2不能立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。2.2.3不能就地取脑时，小动物可送检完整的新鲜尸体，大动物可送检未开的头颅。2.3标本片的制备
2.3.1对新鲜脑组织，可用外科刀切开，以通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每张载玻片可接触2～3个部位，每份材料做3～4张。2.3.2在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片方法同2.3.1。2.3.3所有压印片于室温下干燥后，浸人甲醇溶液固定2min。2.3.4经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。2.4染色
2.4.1赛勒氏染色法
在经过甲醇固定并风干的压印片上，滴加赛勒氏染色液（以盖满压印面而不溢为度）着染5s~10s，然后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。2.4.2曼氏染色法
2.4.2.1将经过甲醇固定并风于的压印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸人曼氏染色液中浸染。压印片浸染5min，切片浸染时间因温度而异（室温下24h，或38C温箱中12h，或60℃温箱中2h）。2.4.2.2以蒸馏水快速洗去染色液，至无浮色出现为止，用吸水纸吸干。2.4.2.3以无水乙醇稍洗，至标本区刚出现蓝色为度。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准146
2002-05-01实施
GB/T 18639—2002
2.4.2.4没人碱性乙醇分化15s～20s，至标本区出现红色。2.4.2.5依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟，分别洗去氧氧化钠和乙醇，再漫入微酸性水中1min～2min。酸化期间，经常于显微镜下观察，至细胞核出现蓝色为宜，如果核蓝色过深，说硼酸化过度，可退回至碱性乙醇，再作短时分化。2.4.2.6以蒸馏水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明，最后加香胶封固。2.5显微镜检查及判定
内基氏小体嗜酸性，位于神经细胞胞浆中，呈圆形、椭圆形或棱形，直径3um～20um，一个细胞内通常含有一个内基氏小体，但也可含有几个。用赛勒氏染色时，内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色，神经细胞的胞核为蓝色、胞浆为淡蓝色，红细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。内基氏小体節狂犬病包涵体，为狂犬病所特有。因此，一旦检出内基氏小体，邸可确诊。但在检查犬脑时，应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、肾盂、胆囊、胆管等器粘膜上皮细胞的胞浆和胞核内。在脑组织内，见于原浆细胞和些小胶质细胞的核内，在神经原内很少见到。
3免疫荧光试验
3.1材料准备
3.1.1器材
荧光显微镜，恒温箱，载玻片（片厚2mm以下），盖玻片，冰冻切片机。3.1.2试剂
3.1.2.1异硫鼠酸荧光黄（FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白（以下简称狂犬病荧光抗体）和未标记抗狂病病毒内种球蛋白（以下简称狂犬病未标记抗体），由制标单位提供。使用时，用0.02%伊文思蓝（Evansblue）染色液稀释成2～4个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1：64，则作1：321：8稀释后使用。wwW.bzxz.Net
3.1.2.2丙酮（分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4C左右。3.1.2.30.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲盐水（PBSS)。3.1.2.40.02%伊文思蓝染色液。3.2样品的采取和运送
同2.2。
3.3标本片的制备
3.3.1病料标本片制备
3.3.1.1按照2.3的方法和要求制得压印片，也可由切面刮取脑细胞泥均勾涂戒直径约1cm的圆形涂抹面，或者参照常规方法将被检脑组织制成厚度在5um～8um的冰冻切片。3.3.1.2标本片于空气中自然干燥，在冷丙酮中固定4h或过夜，然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂洗，取出后十燥，在标本区周围用记号笔划圈，立即染色检查，或密封于塑料袋中，置一20℃暂时保存。3.3.2细胞培养物标本片制备
接种了被检病料的细胞培养物（如神经母细胞瘤细胞），继续在二氧化碳恒温箱中培养48h，随后用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀涂片。当以盖玻片为载体生长的细胞培养物时，则可直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按3.3.1.2风干、固定和保存。3.4染色
3.4.1用吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体，滴加1～2滴于经丙酮固定的标本片上，使其布满整个标本区。
3.4.2将标本片置于糖瓷盘内（盘底垫以浸湿的纱布，纱布上放玻片架），放37C:恒温箱内着染30 min。
GB/T18639—2002
3.4.3取出玻片，用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲去玻片.上多余的染色液，再将玻片连续通过3缸（或杯）磷酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min，并不时轻轻振荡。最后在蒸馏水中浸泡3min。3.4.4在吸水纸土轻轻磕尽玻片上的蒸馏水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液（分析纯中性甘油9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份），覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。3.5对照设置
3.5.1已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。3.5.2已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。
3.5.3巴知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。3.6荧光显微镜检查及判定
一般用蓝紫光，激发滤光片用BG12，吸收滤光片用OG,或GG，以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜油，也可以封片用的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5.1~~3.5.3要求时才能去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒较大，数量不等，位于细胞浆内。凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒感染著。
4小鼠和细胞培养物感染试验
4.1材料准备
4.1.1器材：细胞培养瓶（或管），二氧化碳恒温箱，微量超滤器（滤膜孔径0.45μm），微量组织研磨器，普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。4.1.2试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏（Hanks）液，伊格尔氏（Eagle）最低要素培养液（EMEM），犊牛血清，20000IU/ml.青霉素溶液，20000μg/mL.链霉素溶液等。4.1.3小鼠：无特定病原（SPF)易感小鼠，5～7日龄（也可用3～4周龄者，但发病时间可能稍推迟）。4.1.4仓鼠肾传代细胞（BHK21)或小鼠神经母细胞瘤（NAC1300)细胞。4.2样品的采取和运送
除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集唾液送检。方法是：用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒蘸取腮腺口附近的唾液，置人1mL～2mL内含2%灭活豚鼠血清和抗生素的Hanks液中，低温保存备用。
4.3样品的处理
脑组织用组织研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%（m/V）混悬液，以3000r/min离心30min，吸取上清液，加人青霉素500IU/mL和链霉素500μg/mL，在4℃处理3h~4h，即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。睡液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品，可用0.45μm微孔滤膜过滤法处理。
4.4感染方法
4.4.1小鼠感染法
每份样品用小鼠4～6只。左手固定小鼠，在耳与眼之间用碘酒消毒。右手持吸取接种样品的0.25mL注射器在消毒部位刺人硬脑膜下，每只小鼠注射0.03ml。对照小鼠2只，按同法同剂量注射稀释液（即0.3%水解乳蛋白Hanks液）。每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d。4.4.2细胞培养物感染法
每份样品接种4~6管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Hanks液轻洗3次，每管接种样品0.1mL～0.2mL，在37℃恒温箱内吸附1h，用Hanks液洗1次（亦可不洗）加人含有1%～2%犊1.18
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牛血清的EMEM液（添加量随细胞瓶大小而定），放二氧化碳恒温箱（37C）内继续培养。同时设细胞对照2管，以0.5%水解乳蛋白Hanks液替代样品上清液。每天观察1次，记录是否有致细胞病变作用(CPE)出现。至少观察15d。
4.5感染性鉴定
4.5.1小鼠感染性鉴定
若对照小鼠健活,而样品接种小鼠在接种后 4 d~7 d开始发病，呈现挛、麻痹等神经症状并死亡，可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型，可扑杀取脑，采用内基氏小体检查或免疫荧光试验鉴定之。如果7d后不发病，可将其中2只小鼠放血致死，取脑作成10%（m/V)混悬液，接种健鼠盲目传代；第2代在7d左右还不发病时，再盲传1代；至第3代经4周观察仍不发病时，可报告狂犬病小鼠感染试验阴性。对观察期间死亡的小鼠，应进行内基氏小体检查或免疫荧光检查以鉴别之。4.5.2细胞培养物感染性鉴定
若对照细胞培养物正常，而样品接种的细胞培养物不论是否出现细胞病变，但经免疫荧光试验证实有特异性荧光时，可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间，可在接种后48h抽取1～2管细胞培养物进行免疫荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者，应再育传2次。第3代经15d观察仍无细胞病变和特异性荧光时，可报告狂犬病细胞培养物感染试验阴性。149
A1塞勒（Seller）氏染色液
母液「：美蓝饱和溶液
碱性美蓝
无水甲醇（分析纯）
母液Ⅱ：复红饱和溶液
碱性复红
无水甲醇（分析纯）
母液Ⅱ：无水甲醇（分析纯）
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附录A
（标准的附录）
染色液的配制
使用液：取母液「15ml.与母液Ⅲ25ml.混合，再加人母液Ⅱ2mL～4mL，充分混合，装入褐色瓶中，寒紧瓶塞保存备用。此染色波配制时间越久，染色效果越好。A2曼（Mann）氏染色液
1.0g/100ml.甲基蓝水溶液
1.0g/100ml.伊红水溶液
加蒸馏水至
100 ml.。
配制时.在甲基蓝水溶液和伊红水溶液分别过滤后、各取35ml，再加蒸馏水补足100ml。A3碱性乙醇溶液
取无水乙醇30mlL，加1.0g/100ml氢氧化钠溶液5滴（约0.3ml0.4ml.)即成。A4微酸性水溶液
取蒸馏水30ml，加纯冰乙酸溶液4~~5滴（约0.3ml)即成。附录B
（提示的附录）
人身防护
B1从事狂犬病可疑动物解剖和检疫检验的人员，应穿戴工作服、手套、口罩和防护眼镜，防止感染性病料或气溶胶进人粘膜和伤。工作期间不准吸烟、喝水、吃东西。工作结束时，要洗手洗脸和消毒。B2被狂犬病可疑动物咬伤者，应立即用大量20%肥皂水、0.1%新洁尔灭溶液或清水充分冲洗，再用75%酒精或2%～3%碘酒消毒，彻底清理伤，注射狂犬病疫苗。必要时，应同时注射狂犬病免疫血清（或精制免疫球蛋白）。
B3户体剖检I.作应在病理解剖室内或其他安全地点进行。采完病料之后，应将F体连同污物一起焚殿或深理.不得留作它用。污染的场地、器械和工作服等应彻底消毒。B4作活检的狂犬病可疑动物，在确诊为非狂犬病感染动物之前，应将之严格隔离，防止侵袭其他人畜。15
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