【国家标准(GB)】 猪囊尾蚴病诊断技术

GB/T18644--2002
猪囊尾蜘病（cysticercosis cellulosae）（俗称猪囊虫病），是由寄生在人体小肠内的猪带缭虫（taeniasolium）的幼虫（cysticercuscellulosae）所引起的，是一种危害严重的人兽互源性寄生虫病。世界动物卫生组织[WorldOrganization for Animal Health（英）,OfficeIntentional des Epizootic(法）OIE］将该病列为B类疾病。月前，该病还广泛存在于发展中国家，不仅严重地影响着养猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康，乃至生命。因此，1993年联合国卫生组织将该病列为需要根除的六大疾病之…
猪囊尾蝴病多不表现临床症状。目前，该病的检疫方法有舌检查法和免疫学检查法。前者仅适用于舌上寄生（27%30%）的病猪。后者包括皮内变态反应、炭粒凝集试验、间接红细胞凝集试验、补体结合反应、琼脂扩散试验、免疫电泳和酶联免疫吸附试验（ELISA)等等。其中，ELISA法具有高敏感性和特异性，是最常用的一种方法。
本标准从病原分离、鉴定和血清学（ELISA方法）两方面规定了猪囊尾蜘病检查方法，结果更为可靠。
本标准规定的ELISA法，适用于感染猪的定性，最早可以检出感染9天的囊尾蜘病猪。也适用于免疫猪群抗体水平的评估。
本标准的附录A为标准的附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：韩宇、姜秀云、赵权。173
1范围
中华人民共和国国家标准
猪囊尾蝴病诊断技术
Diagnostic techniques for cysticercosis cellulosaeGB/T186442002
本标准规定了猪囊尾坳病的病原分离与鉴定和酶联免疫吸附试验（ELISA)两种诊断技术。本标准适用于猪囊尾坳病的诊断和流行病学调查以及检疫2病原分离与鉴定
2.1病原分离
2.1.1样品采集
采集猪的咬肌、舌肌、内腰肌、膈肌、肋间肌、肩脚肌等，亦可采集脑、心脏、肝脏、肺脏等。2.1.2样品分离
成熟的猪囊尾劾为长椭圆形［（6mm～10mm）×5mm」，半透明的囊壁内充满液体，上有 个黍粒大小的白色小结节即为头节（scolex）和颈节（neck）。脑内寄生的则为圆球形$8mm～10mm。将上述任何部位的囊尾蝴，以手术刀和镊子剥离后，以生理盐水洗净，并用滤纸吸干。2.2病原鉴定
2.2.1分离样品的压片制备
以剪刀剪开囊壁，取出完整的头节，再以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片，于两张载玻片间加人1～2滴生理盐水后置于显微镜下镜检。2.2.2镜检
以低倍（物镜8倍、目镜5倍)观察囊尾蝴头节的完整性。2.2.3结果判定
低倍镜检，可见到头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘，即判为猪囊尾坳。3酶联免疫吸附试验（ELISA）
3.1材料备
3.1.1器材
ELISA反应板、酶联免疫检测仪、加样器、洗瓶、10cmX1cm普通滤纸条等。3.1.2试剂
猪囊尾蝴层析抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA)辣根过氧化物酶（HRP)标记物（HRP-SPA）、猪囊尾蝴标准阴性和阳性全血滤纸片等。3.1.3被检猪全血血片
将10cm×1cm普通滤纸条的一端标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液1～2滴，于室内阴干后，置于4C冰箱内（可保存6个月）。3.1.4溶液配制
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准174
2002~05-01实施
GB/T18644-2002
溶液配制的方法见附录A（标准的附录）。3.2操作方法
3.2.1抗原包被
3.2.1.1首先以抗原包被液（见附录A中A1)洗涤EI.ISA反应板各孔三次。3.2.1.2以抗原包被液将抗原按使用说明书稀释至工作浓度。3.2.1.3用加样器加E作浓度抗原至EI.ISA反应板各孔内，每孔0.1mI，加盖后置于室温（11C～29（）过夜。
注：包被过夜的FI.ISA反应板加盖后置于冰箱冷冻室内（可保存6个月）。或将包被过夜的ELISA反应板按3.2.2方法洗涤后，晾干，装人塑料袋内密封，置于4（冰箱内（可保存1个月）。3.2.2洗涤
用力甩净包被过夜的EL.ISA反应板孔内的抗原包被液，每孔加人洗涤液（见附录A中A2），浸泡3min后，用力甩去洗涤液，并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加人洗涤液，按同样方法共洗涤3次，即3×3min冲洗。
3.2.3而片的处理
将被检il片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1cm×1cm大小，分别置于青霉素瓶内，每1cm×.1cm血片加人稀释液（见附录A中A2)0.3mL，浸泡20min，即血片变白后即可。3.2.4加样
3.2.4.1每份被检血片浸液加两孔，每孔0.1ml。3.2.4.2#
标准阴性、标准阳性对照孔加相应血片浸液两孔，每孔0.1mI.。3.2.4.3空白对照孔加稀释液两孔，每孔0.1mL。3.2.4.4加样后加盖，于室温（11C～29C）放置30min。3.2.5洗涤方法同3.2.2。
3.2.6加酶标记SPA
3.2.6.1HRP-SPA标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。3.2.6.2
被检孔、标准阴性孔和标准阳性孔每孔加HRP-SPA标记物0.1mI.。3.2.6.3空自对照孔亦加0.1ml。3.2.6.4加完后加盖，于室温（11C～29C)放置30min。3.2.7洗涤方法同3.2.2。
3.2.8加底物
每孔加现配制的底物溶液（见附录A中A3)0.1mL，于室温（11C~29C）放置10min。3.2.9终止反应
孔加终止液（见附录A中A4)2滴，以终止反应。3.3判
在对照孔成立的前提下，即在标准阳性孔呈深黄色，标推阴性孔呈无色或浅黄色，空白孔呈无色，判定检测结果。
3.3.1日测判定
与标准阴性孔相比，颜色深于标准阴性孔者，即判定为ELISA法阳性病猪（十）。3.3.2酶联免疫检测仪判定（490nm）以空对照孔调零，测定被检孔透光（OD)值。当OD≤0.22，判定为ELISA法阴性（一）；当（)D≥0).26，判延为FI.ISA法阳性（+）；当0.23≤D≤0.25，判定为ELISA法疑似（士），疑似者复检一次，仍为疑似则判为阳性。
A1抗原包被液（碳酸盐缓冲液，pH9.6)B：碳酸钠（Na,CO，）
蒸馏水
C：碳酸氢钠(NaHCO,）
蒸馏水
GB/T 18644 ---2002
附录A
（标准的附录）
溶液配制
B、C两液混含即为抗原包被液，测pH(现用现配）。A2稀释液（吐温-磷酸盐缓冲液，pH7.4）B：磷酸氢二钠(Na2HPO·12H2O)蒸馏水
C：磷酸二氢钠(NaH,PO,·2H,O）蒸馏水
B、C两液混合后，加氯化钠（NaCI)19g和少许蒸馏水，溶解后加蒸馏水至2500mL，然后再加人吐温-20Tween-20)1.25mI，即为稀释液，测pH（现用现配）。该试剂既是被检猪抗体的稀释液，又是洗涤液。A3底物溶液（磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0）B：柠蒙酸（无水）
蒸馏水
C：磷酸氢二钠(Na2HP)，·12H20)）蒸馏水
取B液24.3mL、C液25.7mL和蒸馏水50ml.，混合后加邻苯二胺0.04g，避光溶解后，加30%过氧化氢（H,O,)0.45mI.，混匀后立即使用。A4终止液[2 mo1/L硫酸(H2SO)）蒸馏水
浓硫酸（96%～98%）wwW.bzxz.Net
混勾即可。
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