【国家标准(GB)】 蓝舌病诊断技术

GB/T186362002
本标准根据我国近二十年对蓝否病诊断的研究成巢和技术的发展，参考世界动物卫生组织［WorldOrganizationforAnimalHealth（英），OfficeIntentional desEpizootic（法）.OIE］标准性文件《世界动物卫生纽织推荐的诊断方法和生物制品标准手册》2.1.9条“蓝舌病\和澳大利亚动物疫病标准诊断方法\Bluetonguc”章而编写的。本标准引用了GB/T18089-2000《微量中和试验及病毒分离和鉴定方法》有关规方法。
蓝舌病是由库螺传播、蓝舌病病毒引起的侵害反鱼动物的严重传染病。蓝舌病病毒系呼肠孤病毒科环状病静属B群成员。国际已知有24个血清型，在血清学上与环状病毒属相关病避有交叉反应：该病静主要引起绵羊发病和死亡，牛及其他反动物常为隐性感染，但可通过媒介昆虫传播本病。鉴于该病的诊断和检疫技术复杂，因此应建立该病的综合诊断技术标准，这是制定本标准的宗旨。本标准规定的方法、分别适用于病毒分离鉴定、病原检测、病毒血清型鉴定和抗体检测等不同需要。本标准的附录A、附录B都是标准的附录，附录（是提示的附录。本标准华人民共和国农业部提出。本标准山出全动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：云南省热带亚热带动物病静病重点实验室、农业部动物检疫所、大津动植物检疫扇
本标准主要起草人：张念祖、杨承谕、李志华、张富强、胡玉玲、张开礼、马洪超、赵祥平、向文彬5
1范围
中华人民共和国国家标准
蓝舌病诊断技术
Diagnostic techniques for bluetongue本标准规定了蓝否病的诊断技术和程序。GB/T18636-2002
本标准适用于监舌病的诊断和检疫。4、5、6章用于病毒分离鉴定和病原检测，7、8章用于病毒的血清型鉴定，9、10章用于抗体检测。2引用标准
下列标准所包括的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T18089-2000蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法3病毒分离和鉴定
3.1器械和设备
3.1.196孔组织培养板（平底，简称96孔板），单道微量加样器（0.5μ叫l.～10μl，5μl～10μl.40μl~200l200μl～1000μL）及滴头，八道连续加样器（50μl，100μl150μl，200l）及滴头。3.1.24（、-·20（、--80（冰箱，普通恒温培养箱及一氧化碳培养箱。3.1.3鸡胚开孔器，照蛋箱或鸡胚用灯，组织捣碎器及擦镜纸（高压灭菌备用）。3.1.4超声波粉碎器，低速离心机，倒置显微镜及荧光显微镜。3.2试剂与材料
3.2.1肝素抗凝血采血臂。
3.2.2细胞：蚊子细胞（C6/36）、仓鼠肾细胞（BHK2）或非洲绿猴肾细胞（Vero）。3.2.3细胞培养液及分散液（按常规配方配制）。3.2.4蓝否病单克隆抗体（8A3B6、7D3A2）。3.2.5蓝舌病荧光抗体。
3.2.610～11日龄鸡胚。
3.3病毒分离
3.3.1样品的采集和制备见GI3/T18089--2000中8.1。3.3.2鸡胚接种见GB/T18089--2000中8.2。3.3.3接种细胞
3.3.3.1将捣碎的鸡胚肝组织离心，2000r/min，10min，取上清液。为避免不必要的\育传”，先对待分离材料进行捕获酶联免疫吸附（EL1SA）试验（见第6章），将呈阳性的反应材料接种C6/36细胞，份样品接管（瓶），管（瓶）接0.2ml。将接种细胞置于30C温箱培养7d。3.3.3.2吹打接种的C6/36细胞，接种于BHK21细胞，每份C6/36接种八管（瓶）BHK21，每管0.2mL，接种的BHK2.细胞置于37（环境中，吸附1h，加人维持液，37C继续培养，逐日观察细胞病变。出现细中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准116
2002-05-01实施
GB/T18636—2002
胞病变(CPE)者收获，无细胞病变(CPE)者在BHK,细胞育传代,仍无细胞病变弃之。3.3.4病毒保存及L作液的制备
3.3.4.113HK2上出现细胞病变的病毒悬液用1ml.无菌小管分装，作为原始毒，置··80C保存。3.3.4.2用原始毒于BHK细胞上扩增，分装保存，记为“原始毒十1”3.3.4.3“原始毒十1”按3.3.3.2方法增殖，分装、保存，作为贮存毒液。3.3.4.4贮存毒液增殖分装，4C保存，作为工作毒液，用于病毒鉴定。3.4病毒鉴定
鉴定方法见GB/T18089--2000中9.1及本标准4.6。4免疫酶染色（immunocnzyme stain）4.1器械和设备
4.1.196孔组织培养板（平底），单道加样器（0.5μl.~10l5l.10u、200μ200μ~1000ml）及滴头，八道加样器（50μ，100μl，150μL.200l.）及滴头.稀释试剂用小瓶，4.1.2普通恒温箱（37C）4C、-20C冰箱及倒置显微镜。4.2试剂与材料
4.2.1病毒分离获得的未知毒株。4.2.2仓鼠肾细胞（BHK，），使用浓度2.5×10°个/mL~3.3×10°个/mL。4.2.3培养液基础培养液/汉克氏液（BHE/HANKS)液+10%犊牛i清+1兴青罐素、链霖素液（最低浓度为100 IU或μg/ml，4C保存）。4.2.4蓝舌病单克隆抗体（8A3B6，7D3A2）.4C保存，羊（或免）抗鼠免疫球蛋白G（IgG）辣根过氧化物酶联结合物。
4.2.5IgG浓度1.3mg/ml，在一20（以下保存。4.2.68%的福尔马林（即37%~～40%甲醛水溶液）。4.2.7溶液配制：磷酸盐缓冲液（pH7.4）+0.05%吐温-20(PBST）1%明胶PBST。
底物3-氨基-9-乙基咔唑（AEC)液配制方法见附录A（标准的附录）。4.3操作程序
4.3.196孔组织培养板中加待检病毒（3.3.4.4）、每个样品4孔，201./孔。4.3.2设细胞对照4孔（加细胞生长液20μl./孔），阳性对照4孔（加已知蓝舌病病毒悬液20uL/孔），阴性对照4孔（加其他环状病毒群成员如鹿流行性出血病病毒20u1./孔）。4.3.3每孔加人BHKz细胞悬液180μl（2.0×10°个/ml.）.置37（:5%二氧化碳中培养，逐日观察4.3.4当样品孔出现细胞病变时，每孔加人8%福尔马林200μl，室溢静置10min，移弃福尔马林和细胞培养液。
4.3.5用PBST（见附录13)洗涤5次。4.3.6加单克隆抗体（8A3BG+7D3A2；用含1%明胶的PBST作1：5稀释）50叫L/孔，放于湿盒中，37C，孵育90min。
4.3.7用PBST洗涤5次。
4.3.8加酶结合物（抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，用含1%明胶的PBST作1：1000稀释)50μI./孔，放于湿盒中，37（，反应90min。4.3.9加底物（AEC)，每孔100μl，室温静置30min，用倒置显微镜观察。4.4判定
阴性对照、细胞对照不着色，而阴性对照中的感染细胞被染成红棕色时，试验成立，样品中有红棕色细胞，则判别为阳性（表明此样品为蓝舌病病毒），香则，判为阴性。117
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5抗原捕获酶联免疫吸附试验（antigcncaptureEl.lSA）5.1器械和设备
5.1.196孔高吸附性酶标实验板，单道加样器（0.5μl～10ul、5叫l.～40μl40叫.～200l200ml，～1000ml）及滴头.八道加样器（50μ00μl150μl，200μ）及滴头，稀释试剂用小瓶。5.1.2普通恒温箱（37（），水浴箱（37C），4、一20C冰箱，微量振荡器，混合仪，酶标洗板仪及酶标读板仪。
5.2试剂与材料
5.2.1捕捉抗体：牛抗活病病毒-23(BTV-23）型抗体，一20C保存。5.2.2检测抗体：免抗蓝舌病病毒-20(BTV-20）型核芯抗体，一20（保存。5.2.3结合物：抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物，4（保存。5.2.4溶液配制：碳酸盐缓冲液（pH9.4），乙酸-柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）；磷酸盐缓冲液（pHI7.4）。四甲基联苯胺诺存液（室温避光保存）；30%过氧化氢（H0，）；
含脱脂奶的PBST(PBST-SM)
配制方法见附录3（标准的附录）。5.2.59～11日龄鸡胚。
5.3样品处理
5.3.1对细胞培养物样品不需特殊处理.使用前用P13ST对倍稀释。5.3.2对临床样品的处理方法见3.3.1。5.4实验设计和样品编号
5.4.1每个样晶2孔.同时设蓝舌病病毒-1(BTV-1）、蓝舌病病毒-23（BTV-23)阳性对照各2孔.阴性对照2孔（对照已知蓝舌病阳性和阴性细胞培养物或鸡胚肝脏悬液）。5.4.2包被：用碳酸盐缓冲液（现131)对捕捉抗体作1000倍稀释，加人酶标实验板50ul./孔，置密闭混盒中，4（过夜。
5.4.3用PBST（见B1)洗涤5次并晾十。5.4.4加待检样品：按实验设计每孔加样50μuL后，室温静置60min，再在37C振荡30min5.4.5用PBST洗涤5次。
5.4.6加检测抗体：用BPST-SM（见132)对检测抗体作1：2000稀释，每孔50μl.加入实验板，37C振荡 30min。
5.4.7用PBST洗涤5次。
5.4.8加酶结合物：用BPST-SM对酶结合物作1：3000稀释，每孔50μL加人实验板，37C振荡30 min。
5.4.9用PBST洗涤5次。
5.4.10加底物：按以下比例对底物进行稀释，9.7ml.乙酸-柠檬酸缓冲液+50μl.30%过氧化氢+300ul.四甲基联苯胺储存液（见附录C)，每孔50叫l.加人实验板，37（避光反应10min～15min，用2 mol/l.的硫酸50μl/孔.终止反应。5.4.11在酶标读板仪读取280nm波长的吸光度值。5.5结果判定
在阳性和阴性对照成立的前提下，当样品孔光吸收值为阴性对照孔两倍或网倍以上时判为阳性（表明样品中存在舌病抗原），否则判为阴性。118
6定型微量中和试验
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6.1器械和设备
6.1.196孔组织培养板（平底，简称96孔板），单道微量加样器（0.5μl.～10μl、5ul.~10ml.、40pl200μl200μl1000μL）及滴头8道连续加样器（50μl100μl，150μl，200μl）及滴头。6.1.24（、20（及-~80C冰箱，普通恒温培养箱及二氧化碳培养箱。6.1.3倒置显微镜，微型振荡器及磁力搅拌器。6.2试剂与材料
6.2.1病毒
待定型病毒须经群特异性试验鉴定为蓝舌病的毒株并经3次克隆达到纯化；对照病毒为蓝舌病病毒24（BTV-24)型标准株。
6.2.2阳性血清（抗血清）
蓝舌病毒24个血清型国际准抗血清型（或应用蓝舌病毒24个血清型国际准毒株自制，中和抗体效价应尽可能高，筛检试验不低于1：20，校正试验不低于1：320，并无细胞毒性）。6.2.3阴性血清
无蓝否病抗体和细胞毒性的新生犊牛血清。6.2.4细胞
非洲绿猴肾细胞（Vero）、使用浓度1.5×10°个/ml.。6.2.5细胞生长液
199培养液+双抗各含200单位（ug）/ml.十10%新生犊牛血清（不含蓝舌病抗体，使用前56（，30min灭活）。
6.2.6细胞维持液
199培养液+双抗各200个单位（μg）/ml，亦可加2%胎牛血清（FCS）（同上）。6.2.70.1%萘黑蓝染色液（见C6）。6.3试验准备
6.3.1病毒繁殖
应用转管或静止培养方法，在Vero细胞在转管中形成单层后，换为维持液，将待检病毒接入，37C培养，连续观察7d，记录细胞病变结果。病毒要在Vero细胞上适应3~5代，用1ml吸管充分吹打管壁，取病毒悬液用同样的方法传代，最后代的病毒液分装于1ml.小管，作为检测病毒贮存液-80C保存。使用时接种于单层细胞上，37C培养，逐日观察，待细胞病变达到75%以上时收毒，在一80（和4间冻融三次，置无菌离心2000r/min离心20min，取上清液分装于1ml.小管，4C保存备用。6.3.2毒价滴定
用细胞生长液将病毒作10:1~10稀释，加进96孔板，每个稀释度8孔，每孔50ul，再加细胞生长液50μl。细胞对照8孔，仪加细胞生长液100μL，然后每孔各加人细胞悬液100μl，置37℃二氧化碳培养箱内培养（二.氧化碳浓度为5%），观察10d，在细胞对照成立的前提下，记录结果，按细胞半数感染量（Karber)方法[见附录C（提示的附录）计算病毒的每50ul中所含50%组织细胞感染量。6.4筛检试验
6.4.1实验设计及记录表见表1。119
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各型BTV血清和对照排列
1表中粗黑框表示细胞培养板内各孔的布位。1～9为检测区，10～12为对照区。2黑框内数学表示不同型标准血清的型号，每型血清各加人3孔。3V表示病毒对照，VI0\~~V10\34个稀释度，每个稀释度占用4孔。4C.C.表示细胞对照。
5S为阴性血清对照。
6本表如不填写工述数字，即可作记录表用。6.4.2阳性血清经56C30min灭活后，作1：20稀释。12
V10°2
6.4.3将待检病毒用细胞生长液稀释为每50μL含100个TCID50，作为病毒工作液。6.4.4将试验各组分加入微量反应板，程序是：a）50μl阳性血清；
b）50μl.病毒液（待检样品孔为每50μL含100个TCIDso）；c）振荡后置37（中和1h；
d）100ul.细胞悬液（1.5×106个细胞/mL）。1述液体总量200μl.。
6.4.5对照
a）病毒对照：取病毒工作液，用细胞生长液作稀释10°、10-1、102、10-\四个稀释度，每个稀释度4孔，每孔50μ，加100ul细胞悬液，补生长液50达到总量200μl。b）细胞对照：设4孔，每孔加细胞悬液100ul，补生长液100μL达到总量200uL。c）阴性对照：设4孔，每孔加人1：20稀释的阴性血清50μL，蓝舌病病毒工作液50μl，细胞悬液100μl。
d）置37（培养箱（二氧化碳浓度为5%)培养10d。如长期保存可用0.1%萘黑蓝染液染色，每孔加染色液50L～100L，室温静置2~3h，用水漂洗，晾干。
6.5筛检结果判定
6.5.1判定条件
6.5.1.1细胞对照组应不出现细胞病变。6.5.1.2病毒对照，应保证在100个TCIID5的病毒液10°和10稀释度的各孔均出现CPE，10有1～2个孔出现细胞病变，1034孔全无细胞病变。6.5.1.3阴性对照应全部出现细胞病变。6.5.2判定标准
在以上对照成立的情况下，如出现细胞病变记为CPE+，如不出现细胞病变为CPE一。若某型抗120
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体组均无细胞病变，其他型的抗体组均有细胞病变，则可初步认为是该Ⅲ清型病毒，再按6.5.3进一步确认；若两个或两个以上的血清型抗体组无细胞病变，则认为可能是其中的某个型，按6.5.4作进一步鉴定；若所有抗体组均出现细胞病变，按6.5.5进行。6.5.3病毒仅被某型标准阳性血清中和将待定型病毒与初定型的同型标准毒分别作10-1～106稀释，每个稀释度加8孔，每孔50μL，其中前四孔每孔加1：20稀释的初定型标准阳性血清50ul.，后四孔每孔加1：20稀释阴性的特牛血清50ul.，振荡混勾，37，5%二氧化碳培养箱中培养10d，判定结果。当标准毒的标准毒阳性血清中和滴度较其阴性血清孔高2个或2个以上，而待检病毒也出现类似情况，则可判定为该型病毒。6.5.4有细胞病变的两型的抗血清（已知滴度），分别作1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320等倍比稀释，每稀释度均为4孔，每孔各加100TCID50被测病毒，各种试剂的加样量和顺序按6.4.4进行。以四孔完全抑制细胞病变的最高稀释度作为判定终点，若某型抗体中和滴度比其他型高出2个或2个以上并与标准毒试验结果基本一致，则可定为该型。6.5.5均不被24个血清型抗体中和的病毒，可能为多型混合感染或新的血清型，则需进行克隆化，克降化的病毒再按上述方法作血清型特异鉴定，若仍然不被24个血清型抗体中和，则可能属于新型。7空斑及空斑抑制定型试验
7.1材料准备
7.1.1传代细胞生长良好的SVP(非洲绿猴肾细胞系中--种特殊细胞株)或Vero传代细胞，在直径为6cm或直径9cm的培养皿中4872h长成致密单层。7.1.2参考阳性血清：以124型蓝舌病毒制备的无菌高效价、型特异性血清，琼扩效价在1：2以上，-20（保荐。
7.1.3病毒：将保存病毒在敏感细胞上繁殖数代，反复冻融三次，离心取上清液，一70℃保存。7.1.4滤纸圆片：直径为0.2cm定量分析滤纸片，置小容器内103.4kPa（15磅/时\，121C）30min高压灭菌，烘箱内烘十备用。
7.1.50.1%中性红：双蒸的无离子水配制0.1%中性红，2143Pa高压灭菌30min，4C冰箱保存备用。7.1.6低熔点琼脂糖：以磷酸盐缓冲液将低熔点琼脂糖配制成1%浓度，103.4kPa高压灭菌30min，溶解后放43（水浴锅备用。
7.2空斑试验
7.2.1将长满单层的培养Ⅲ营养液倒出，用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗两遍。7.2.2将病毒用磷酸盐缓冲液从10-1～10*递次稀释，每血加0.3ml(6cm盘）Ⅲ或0.75mL（9cm血）。37（感作40min吸出病毒液。7.2.3用磷酸盐缓冲液轻洗3次。将0.1%中性红按1：100的比例加入低熔点琼脂糖中，在超净台冷却1min后，轻轻倒人5mL（6cmⅢ）或15mL（9cm皿），30min后，倒置37℃二氧化碳培养箱中。7.2.424h后，逐日检查空斑情况，至120h止，判读结果。蓝舌病病毒空斑，在SVP或Vero细胞上出现有径约1mm近圆形白色空斑，健康细胞层颜色为深红色，计数各稀释度空斑数并作记录，计算每毫升窄斑形成单位（PEU/mI.）。
7.3空斑抑制试验
7.3.1将培养好的单层细胞用磷酸盐缓冲液轻洗2遍，将待检病毒稀释至106PFU/mL，每盘放入0.3ml（6cmⅢ）或0.75ml（9cmⅢ）,37C感染40min，吸出病毒液。7.32将培养血用磷酸盐缓冲液冲洗3遍，将0.1%中性红按1：100比例加入已溶化43C的1%琼脂中，摇匀，轻轻倒人Ⅲ中，6cm Ⅲ加5mI9cm皿加15ml，静置30min。7.3.3将24个型参考阳性血清按-定顺序，用滤纸片浸人血清后，轻轻置于琼脂上静置15min后，记清型号倒置二氧化碳培养箱37（培养。121
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7.3.448h后逐日观察结果，测量抑制圈直径。并作好记录，拍照，按7.3.5判定。7.3.5结果判定
相应型面清的抑制圈为围绕血清滤纸片的边缘较整齐的深红色的环形带，直径般在1.2cm～2.0cm左右，可判定某病毒为该血清型；个别情况下，另型也同时出现一定的抑制圈，但抑制圈的真径一般不超过0.6cm，边缘较不整齐，颜色亦较淡，此为交叉反应所致，应加以鉴别。必要时，可重复试验。
8琼脂免疫扩散试验（AGID）
8.1材料和器械
8.1.1抗原和阴、阳性血清
按说明书要求使用。
8.1.2器械
直径6cm平Ⅲ；
外径4mm打孔器；
眼科于术镊子。
8.1.3待检血清
血清应无污染，3个月内在4C保存，常温保存15d内，可用于检测。8.2试验方法
8.2.1琼脂平皿的制作
8.2.1.1琼脂糖基配制：
琼脂糖
牛理盐水
0. 8 g~0. 9 g
按1：10000比例加人氮钠或硫柳汞，调整pH7.4～7.6，高压消毒10min。8.2.1.2琼脂平皿制备：融化的琼脂待冷至45C～50C时，以无菌手术倒人直径6cm平盟中，每平皿约7ml。厚度约为4mm，待凝固后置4C保存备用。8.2.1.3打孔：用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平Ⅲ上打孔（各孔排例如图1所示）。孔距为3mm，打孔后用针挑出切下的孔内琼脂块，封底。@?
图１布局
8.2.2加样：用微量加样器或毛吸管，吸取抗原或血清滴于孔内；中央孔滴加抗原，周围的1、3、5孔滴加待检血清，2、4、6孔滴标准阳性血清，样品以加满不溢出为度。加样后静置10min，放入37C温箱中进行反应。分别在24h、48h、72h观察并记录结果。8.3结果判定
判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察。标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则认为试验可以成立；如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立，应重做。结果判定标准如下：
a）阳性：待检血清孔与抗原孔之间出现明显清晰自色沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合（见图2)；
b）阴性：待检血清孔与抗原孔之间无沉淀，标准阳性血清孔的沉淀线真伸孔边，判为阴性（见图3）：
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c）弱阳性：标准阳性血清孔沉淀线在被检孔处向抗原孔侧弯曲，但不形成完整的线，则待检血清判为弱阳性，应重复试验、若重复仍为弱阳性反应时判阳性（见图4)；d）非特异性反应：在抗原孔与待检血清之间的沉淀线粗而混浊，或与标准阳性血清孔沉淀线交叉并直伸孔边时则认为非特异性反应，应重试（见图5）；e）试验后24h、48h、72h判定中凡出现沉淀线均应记录，并判为阳性，凡72h仍未见沉淀反应者判为阴性。
图2阳性（1.3.5）
图3阴性（1.3.5）
9竞争酶联免疫吸附试验（C-ELISA）9.1材料
9.1.1化学制剂溶液
吐温-20磷酸盐缓冲液（见B1）；@?
图4弱阳性（5)
底物（四甲基联苯胺溶液，TMB)储备液（见C3)；样品稀释液［含脱脂奶的PBST(PBST-SM)T(见C4)。9.1.2生物制剂
图5非特异性（3.5）bzxz.net
9.1.2.1阳性对照血清：此血清以1：10、1：80被稀释作为强、弱阳性对照血清。9.1.2.2阴性对照血清：蓝舌病抗体阴性的牛血情，试验中以1：10对照稀释。9.1.2.3单克隆抗体（单抗）：蓝舌病毒VP7的单克隆抗体（群特异性单抗）。9.1.2.4酶结合物：辣根过氧化物酶交联的山羊抗小鼠血清。9.1.2.5设备和器械：
96孔酶联免疫吸附试验（ELISA）反应板；带嘴塑料瓶（500ml），用手洗板；加样器（10μL、50μL100uL～200μ多道加样器）；酶标仪（使用波长为450nm）。
9.2试验程序
9.2.1包被抗原
按照说明书将抗原稀释到工作浓度，每孔加50μL，在室温保湿条件下过夜。用PBST洗板5次，铝箔纸密封4C保存。
9.2.2加样
将待检血清用PBST-SM作1：10稀释，每孔加50μL，每份样品使用两孔。空白对照两孔，各加PBSI-SM50 μL c
强阳性血清对照两孔，各孔加50μL弱阳性血清对照两孔，各加人50叫l；阴性血清对照两孔，各加人50μul。9.2.3反应
置37（温箱振荡1h。
9.2.4加单克隆抗体
按照说明书要求用PBST-SM将单抗稀释到工作浓度，每孔加50μl。37C温箱振荡30min。9.2.5加酶结含物
GB/T18636—2002
按说明书将酶结合物用PBST-SM稀释到工作浓度，每孔加50μuI。37C振荡30min。9.2.6用PBST洗板5次。
9.2.7加底物和终止
将新配制的底物（见5.4.10）液迅速向每孔加人100μl，反应10min~~20min。每孔加终止液100μl。
9.3读数和判定
9.3.1读数用酶标仪设置对照孔，以波长450nm读取每孔吸光度值。9.3.2计算抑制率：以式（1)计算抑制率（1)：I(%) = (1 -
式 A,-
样品吸光度；
A.—标推阴性吸光度。
9.3.3判定前提：阴性对照吸光度（A,)应在范围0.8~1.4内；强阳性抑制率应大于85%；弱阳性抑制率应在35%～50%之间。如果实际值与此值偏离较大，则不具备判定条件。9.3.4判定：样品的抑制率（I)大于60%判为蓝舌病病毒抗体阳性；小于40%判为阴性；40%~60%判为弱阳性，应重复，如仍为此值可定为弱阳性。124
A1PBST
氯化钾（KCI）
磷酸氢二钠（Na,HPO）
磷酸二氢钾（KH,PO）
加水至
吐温20
A2 1%明胶 PBST
GB/T 18636—2002
附录A
（标准的附录）
免疫酶染色所需试剂
1000ml
称取明胶，加PBST100mL，水溶解，4C保存备用。A33-氨基-9-乙基味唑（AEC)液
3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）
二甲基亚砜(DMSO)
将AEC于DMS()中溶解后，加至50mI.乙酸盐缓冲液（pH6.0)中，再加30%过氧化氢30μl.充分混匀备用（该溶液不适宜保存，现用现配）。附录B
（标准的附录）
抗原捕捉酶联免疫试验和定型微量中和试验用试剂溶液0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6包被用）B1
碳酸钠（Na2CO,）
碳酸氢钠（NaHCO,）
硫柳汞
加蒸馏水至
B2乙酸-柠檬酸缓冲液
甲液：
乙酸钠
双蒸馏水
乙液：
柠檬酸
双蒸馏水
用乙液调整甲液至pH9.6，高压灭菌4C保存。1.59g
1000mL4℃保存备用
1000ml
B3四甲基联苯胺(TMB)储存液
称取3°-3'，5，5四甲基联苯胺30mg于100mlL甲醇中，室温搅拌数小时至完全溶解，用棕色瓶避光保存。
B4PBST-SM
脱脂奶粉
B52mol/L硫酸
双蒸馏水
浓硫酸
B60.1%蔡黑蓝染色液配制
萘黑（naphthalencblack）
乙酸钠(尤水）
加蒸馏水至
GB/T18636—-- 2002
160 ml
100 mL
附录C
（提示的附录）
Karber 方法
Karber法的公式见式(C1)用常用对数（Ig）计算：lgTCID,(或 LD50、EIDs) = L +d(s-0. 5)式中：L---病毒的最低稀释倍数；d—稀释系数，即组距；
-细胞病变比值的和（不包最低稀释度细胞病变的比值）。以下例(见表C1)说明；
病毒稀释度
病毒稀释度
细胞病变比值
本例 L=
病毒TCID滴定
2.d=--1,s=4/4+4/4+3/4+2/4+0/44.25代人公式：lgTCID)so—2+（—1）×（4.25—0.5）5.75
TCID5=10 5. 75
查反对数表可得TCIDsm=1/56000010-5
如稀释度均为0.1ml，那么1mL中含5600000个TCIDm或106.75个TCID50g.(C1)
病毒毒价通常以每毫升含多少TCIDs（或LID5、ELD）表示，本例病毒毒价为每毫升含5600000个 ICID.
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