【国家标准(GB)】 饲用植酸酶活性的测定 分光光度法

GB/T18634—2002
本标准参考美国公职分析化学家协会（AOAC)方法和国外有关文献资料制定本标准确定了饲用植酸酶的活性单位定义，采用钒钼显色分光光度法测定植酸酶活性。此项标准分为绝对法和相对法，对标准物质和试剂的选择均有详细说明。规定了方法的适用范围，检测原理，检测程序及最佳样品浓度。
本标准的附录A是提示的附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心(北京）、罗氏泰山（上海)维生素制品有限公司、巴斯夫维生素有限公司。
本标准主要起草人：马东霞、苏晓鸥、张苏、王云全、张若寒。293
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中华人民共和国国家标准
饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
Determination of feed phytase activitySpectrothotometric method
本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。GB/T 18634— 2002
本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U/kg。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682--1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987）3植酸酶活性单位定义
样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37C、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1 μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。4方法原理
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的［（NH）.PO,NH.VO：·16MoO.}复合物，在波长415nm下进行比色测定。5试剂和溶液
本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5.1乙酸缓冲液（1），c(CH,COONa·3Hz0)为0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠，0.1g吐温20于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用盐酸调节pH至5.50士0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放2个月有效。5.2乙酸缓冲液（），c（CH.COONa·3H2O)为0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠，5g吐温20，30g乙二胺四乙酸二钠（EDTA）于1000mL容量瓶中，加人900mL水溶解，用盐酸调节pH至5.50士0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。5.3植酸钠溶液c(C.HO2PsNa12)为7.5mmol/L：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(CsH.O24P,Na12）)于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解并定容至刻度，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol/L)。
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准294
2002-07-01实施
5.4硝酸溶液：1+2水溶液。
GB/T 18634 -2002
5.5100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵［（NH.）,Mo,024·4Hz0］于100mL容量瓶中，加人1.0mL氨水（25%)用水溶解定容至刻度。5.62.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵（NHVO）于100mL棕色容量瓶中，加人2mL硝酸溶液（5.4），用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。5.7颜色终止液：移取2份硝酸溶液（5.4），1份钼酸铵溶液（5.5），1份钒酸铵溶液（5.6）混合后使用现用现配。
5.8植酸酶标推品（标明准确活性单位和类型）。5.9磷酸二氢钾（KH2PO,)：基准物。6仪器和设备
实验室常用仪器设备。
6.2恒温水浴：(37±0.1)C。
6.3分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6.4磁力搅拌器。
6.5涡流式混合器。
6.6酸度计：精确至小数点后2位。6.7离心机：转速为4000r/min以上。7试样制备
取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装人密封容器，防止试样成分变化。8测定步骤
8.1绝对法（仲裁法）
8.1.1标准曲线
准确称取0.6804g在105C烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.1)溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例稀释成不同浓度，与试样-起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y二ar+b）。表1
标准序号
8.1.2试样溶液的制备
稀释量/mL
浓度/(mmol/L)
按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，加人约70)ml.乙酸缓冲液（5.1），一个磁力棒，在磁力搅拌器（6.4）上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液（5.1）定容至刻度（减去磁力棒的体积）。摇匀，在离心机（6.7)上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（5.1）稀释，使样液浓度保持在0.4U/mL.左右，待反应。1）添加剂预凝合饲料样品需采用乙酸缓冲液（5.2)。293
GB/T18634--2002
建议在测定样品时附加…个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。8.1.3反应
取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加人底物（5.3)开始，向每支试管中加人试剂的时间间隔要绝对-致，37C水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表2。表2
反应顺序
1.加乙酸缓冲液（5.1或5.2）
2．加人待反应液
3．混合
4.37C预热5min
5、依次加人底物（5.3）
6．混合
7.37C水解30 min
8、依次加人终止液（5.7）
9、混合
总体积
8.1.4样品测定
样品、标准
样品空白(标准空白)
1. 8 ml.(2. 0 ml.)
4 mL(第二步）
4 ml(第-步）
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机（6.7）上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3)415nm波长处测定样品空白（A。）和样品溶液（A）的吸光值，A一A，为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。8.2相对法
8.2.1标准曲线
准确称取定量的标准植酸酶（5.8），精确至0.0001g，于50mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液（5.1)溶解并定容至刻度。做两次稀释使植酸酶活性大约在0.05U/ml.左右，当日配制。将上述植酸酶标准液再按表3比例用缓冲液（5.1)进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度。然后与样品起进行反应测定。以植酸酶浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ar+b)。表3
标序号
8.2.2样品溶液的制备
最终稀释量/mL
2. 5-5. 0
3. 0→5.0
3.5 +5. 0
大约酶活性/(U/mL)
以下操作步骤按8.1.2进行，使样液浓度保持在0.02U/mL左右。待反应。注：添加剂预混合饲料样品需采用乙酸缓冲液（5.2)。8.2.3反应
收10）ml.试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加人底物（5.3)开始，向每支试管中GB/T 18634 -—2002
加人试剂的时间间隔要绝对一致，37C水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表4。表4
反应顺序
1．加人待反应液
2.37C预热5min
3.依次加人底物（5.3)
5. 37（水解 30 min
6．依次加人终止液（5.7）
7．混合
总体积
1）标准空白加2mI.乙酸缓冲液（5.1)。8.2.4样品测定
样液空白
4 ml(第2步）
4mL（第1步）
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机（5.7）上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm波长处测定样品空白（A.）和样品溶液（A）的吸光值，A一A。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。9结果计算和表示
9.1植酸酶活性U按式(1)和式(2)计算9.1.1绝对法
m×30×F
式中：U
试样中植酸酶的活性,U/g；
根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；C-
试样溶液反应前的总稀释倍数；m
一试样质量，g；
30反应时间，min。
9.1.2相对法
中：U
试样中植酸酶的活性，U/g;
-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性U；F—-试样溶液反应前的总稀释倍数；m
试样质量，g。
9.2结果表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。9.3重复性
.....(1)
冏--样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于8%，添加植酸酶的各种饲料样品不大于10%。
GB/T 18634—2002
附录A
（提示的附录）
建议称样量
根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表A1。表A1
植酸酶活性/(U/g）
称样量/g
5～10
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