【国家标准(GB)】 肉中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法 酶抑制法

1CS 67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T18626-2002
肉中有机磷及氨基甲酸酯农药
酶抑制法
残留量的简易检验方法
Method for simple determination of organophosphorus andcarbamate pesticide residues in meat-Enzyme inhibition method
2002-01-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总居
2002-06-01实施
GB/T18626--2002
本标准在制定过程中主要参考了以下标推：言
美国公职分析化学师协会AOAC12h29.049-29.055《食品中有机磷农药残留测定-制法》
本标雅的附录A悬规范性附录。
本标准由辽宁省质量技术监督局提出。本标准由沈阳农业大学、沈阳市质量技术监督局苏家电分局负责起草。本标准主要起草人：周艳明、高淑英、张会娟、王晓光、李衰亮、吴小琳、牛森。366
胆碱酯酶抑
1范围
肉中有机磷及氨基甲酸酯农药
残留的简易检验方法酶抑制法
GB/T 18626--2002
本标准规定了用酶抑制法测定肉中有机磷农药及氨基甲酸酯农药残留总量的简易检验方法本标准适用于肉中有机磷农药及氮基甲酸酯农药残留的测定。2原理
有机磷农药及氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农药种类及其含量。
在pH8的溶液中，碘化硫代乙酰胆碱被胆碱酯酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2，6-二氟靛酚褪色，褪色程度与胆碱酯酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性愈高时，吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸酯类农药存在时，酶活性受到抑制，吸光度值则较高。据此，可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酯类农药的残留情况。样品提取液用氧化剂氧化，可提高革些有机磷农药的抑制率，因而可提高其测定灵敏度，过量的氧化剂再用还原剂还原，以免干扰测定。
3试剂
3.1底物溶液：2%碘化硫代乙酰胆碱水溶液，1g碘化硫代乙酰胆碱，加缓冲液溶解并定容至50mL。3.2缓冲液
pH8三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液:50 mL0.1mol/LTris 加 29.2mL 0.1mol/L盐酸，加水定容至100mL。
3.3显色剂：0.04%2,6-二氯靛酚水溶液。3.4氧化剂：0.5%次氯酸钙水溶液。3.5还原剂：10%亚硝酸钠水溶液。3.6月
胆碱酯酶液，0.2g酶粉（其制备方法见附录A)加10mL缓冲液溶解。3.7
脱色剂：活性炭。
丙酮：分析纯。
3.9碳酸钙：分析纯。
4仪器
分光光度计。
5分析步骤
以下操作可在15C～35C溢度下进行。5.1样品提取
取0.5g肉置于10ml.烧杯中，加5ml.酮浸泡5min，不时振摇再加0.2g碳酸钙。367
GB/T 18626---2002
5.2氧化
取0.5ml.丙酮液于5ml.烧杯中，吹干丙酮后，加0.3mL缓冲液溶解。加人氧化剂0.1mL，摇匀后放置10min，再加人还原剂0.3mL，摇匀。5.3酶解
加人酶液0.2ml，摇匀，放置10min，再加人底物溶液0.2mL，显色剂0.1mL，放置5min后测定。
5.4测定
分光光度计波长调至600nm，其他按常规操作，读取测定值。6结果
6.1测定结果的使用
当测定值在1.0以下时，为未检出。当测定值在1.0～1.3之间时，为可能检出，但残留量较低。当测定值为1.3以上时、为检出。测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。6.2方法最低检出浓度
本方法最低检出浓度见表1。
表 1 最低检出浓度
敌敌畏
对硫磷
甲基对硫磷
敌百虫
甲拌磷
氧化乐果
辛硫磷
最低检出浓度
伏杀磷
内吸磷
甲胺磷
乙酰甲胺磷
二嗪磷
呋哺丹
西维因
抗蚜磷
单位为毫克每千克
最低检出浓度
A.1试剂
A.1.10.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液附录A
（规范性附录）
胆碱酯酶粉的制备
GB/T 18626—2002
0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：17.56g磷酸氢二钠（NazHPO4·2H,O)溶于1000mL水。0.1mol/L磷酸二氢钠溶液：13.80g磷酸二氢钠（NaH,PO.·2H,O)溶于1000mL水。将12.3ml 0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液与87.7mL 0.1mol/L磷酸二氢钠溶液混合，即为0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液。
A. 1. 20. 005 mol /L pH6. 0磷酸缓冲液取50mL0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液(A.1.1)加水稀释至1000mL。A.1.30.5mol/L氢氟化钠-0.5mol/L氟化钠溶液1.0mol/L氢氧化钠溶液：取40g氢氧化钠溶于1000mL水中。1.0mol/L氯化钠溶液：取58.5g氯化钠溶于1000mL水中。将上两液1：1混合，即得0.5mol/L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液。A.1. 40.5 mol/L盐酸-0.5mo1/L氯化钠溶液1.0mol/L盐酸溶液：取83.33mL浓盐酸溶于1000mL水中。将1.0mol/L盐酸溶液与1.0mol/L氯化钠溶液1：1混合，即得0.5mol/L盐酸-0.5mol/1.氯化钠溶液。
A.1. 5羧甲基纤维素(CM-纤维素)干粉A.2２　装置
A.2.1梯度混合器：两瓶连通式，每瓶容量200mL。A.2.2柱层析系统：1.5×40cm玻璃层析柱，流量可达2mL/min蠕动泵。A.2.3冷冻干燥机。
A.3程序
A.3.1羧甲基纤维素的处理
取10g羧甲基纤维素（CM-纤维素）干粉置于烧杯中，加人100mL0.5mol/L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液，混匀，静置15min后，用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于100mL1mol/L盐酸溶液中，混匀，静置10 min后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100ml0.5mol/l盐酸-0.5mol/L氯化钠溶液中，混匀，静置15min后用布氏漏斗抽滤.水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于0.005mol/LpH6.0磷酸缓冲液(A.1.2)中。A.3.2胆碱酯酶的提取
取50g新鲜食用面粉置三角瓶中，加250mL蒸馏水，振荡30min。静置30min以上，取上清液经5000r/min离心20min。收集上清液用冷冻干燥机浓缩至20mL左右，为胆碱酯酶粗提·保存于冰箱中待纯化。A.3.3胆碱酯酶粗提羧的纯化
将处理好的羧甲基纤维素悬浮液加人层析柱中，加150ml0.005mol/lpH6.0磷酸缓冲液369
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（A.1.2)于梯度混合器的初始液瓶中，加150mL0.1mol/L.pH6.0磷酸缓冲液（A.1.1）于梯度混合器的高浓度液瓶中。连接柱层析装置，以2ml./min流速做梯度洗脱，收集后1/2流出液。A.3.4冷冻干燥
将A.3.3中的流出液用冷冻干燥机干燥成干粉，以0.2g/瓶封装于安瓶中备用。置4C冰箱中可保存1年有效。
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