【农业行业标准(NY)】 赤羽病细胞微量中和试验方法

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T549—2002
赤羽病细胞微量中和试验方法
Cells microneutralization test for akabane disease2002-08-27发布Www.bzxZ.net
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T549--2002
赤羽病akabane disease，又名阿卡斑病）是由赤羽病病毒（akabane disease virus）引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病。该病以流产、早产、死胎、畸形产为特征，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑症。
本病的病原是赤羽病病毒，属布尼病毒科布尼病毒属，病毒表面有两种糖蛋白(G1和G)，它们分别诱导中和抗体和血凝抑制抗体产生。本病的血清学诊断方法为细胞微量中和试验。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标推主要起草人：周立桥、李昌琳、封启民、李其平。400
1范围
赤羽病细胞微中和试验方法
本标准规定了赤羽病（akabane disease）细胞微量中和试验技术要求。本标准适用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群体抗体水平的评估。2材料准备
2.196孔细胞培养物，移液器（50pμL、200μL）滴头，无毒透明塑料胶带，小试管。2.2Vero细胞或 SVP细胞。
2.3抗原、标准阳性血清、标准阴性血清。2.4被检血清，无菌采集，不加防腐剂。3操作方法
3.1准备
NY/T 549--2002
3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒（AKV），用199细胞培养液稀释成100TCIDso/50μL，作为工作浓度抗原。
3.1.2被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清均56℃灭活30min，用199液做14稀释（即50μl血清加150μL199液中）。
3.1.3按常规微中和试验法每个样品接种4孔，每孔分别加被检稀释血清和工作浓度抗原各50μl.，轻轻振荡培养板使抗原与稀释血清充分混合，将培养板加盖置37℃培养箱内中和1h。3.1.4每孔滴加SVP细胞或Vero细胞悬液（20万/mL)100L，用透明塑料胶带封板，置37C温箱内培养，用倒置显微镜观察细胞病变情况(通常 72 h内引起细胞病变)。3.2对照设量
每次试验均要设置标准阳性、阴性血清对照、病毒对照、正常细胞对照和抗原实际用量的回归滴度对照。
标准阳性、阴性血清对照，将已稀释好的标准阳性、阴性血清分别加人培养板4孔内，每孔3.2.1
50uL，然后各孔加人工作浓度抗原50μl。3.2.2病毒对照：将工作浓度抗原滴加培养板4孔内，每孔50μL，补加细胞生长液50μL。3.2.3将以上三种对照置37℃温箱内1h，然后于各孔内加人100μL细胞悬液，置37℃温箱内培养，72 h后在倒置显微镜下观察结果。3.2.4正常细胞对照：于培养板4孔内各加100μL细胞悬液，然后再于各孔补加细胞生长液100μL。3.2.5抗原实际用量的回归滴度的测定：在每次试验中，应对使用的100TCIDso/50μL抗原进行实际用量的测定，将工作浓度抗原作10倍递增稀释到10-3，每个稀释度接种4孔，每孔50μL，立即补加细胞生长液50uL，置37℃温箱内1h，然后每孔加人100μL细胞悬液，计算该试验中TCIDs0/50μL的实际用量。
4结果判定
4.1将培养板放置37℃温箱内培养72h进行初判,120h进行终判。在倒置显微镜下检查细胞病变401
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(CPE）。当病毒抗原对照、标准阴性血清加抗原对照均出现细胞病变，标准阳性血清加抗原对照，无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，正常细胞对照亦正常，病毒抗原实际用量在30TCIDso/50 μL～300TCIDso/50μI.范围内方能判定结果，否则被认为无效4.2判定标准：定性试验判读标准是被检血清在1：4及1：4以上稀释度能使50%及50%以上的细胞孔不出现病变者判为阳性。抗体效价滴定的判读标准是以被检血清的最高稀释50%及50%以上的细胞孔不出现病变为该被检血清的中和效价。402
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