【农业行业标准(NY)】 禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 563—2002
禽霍乱（禽巴氏杆菌病)诊断技术Diagnostic techniques for fowl cholera (avian pasteurellosis)2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T563—2002
禽霍乱（fowlcholera），又名禽巴氏杆菌病（avianpasteurellosis），是由多杀性巴氏杆菌引起的家畜和野禽的接触传染性疫病。本病呈现急性败血症变化，其发病率和死亡率很高·对养禽业危害严重.被世界动物！\:组织［World （)rganization for Animal Health（英）,Office Intentional dles Epizootic（法），IE定为B类动物疫病，我国列为二类动物疫病。本标准在主要诊断技术方面与（)IE《诊断试验和疫苗手册珊》（2000年版）第2.7.11条的规定是一致的。但也有以下差异：
()IE《手册》2.7.11条对具体操作程序未作详细描述，本标准则根据实践经验规定了具体操作程序；
本标准未完金采其他推荐性技术。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标雅册全国动物检疫标准化委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：曲连东、吴东来。506
1范围
禽霍乱（禽巴氏杆菌病)诊断技术本标准规定了禽霍乱的诊断技术要求，本标准适用于鸡、鸭、鹅等禽霍乱的诊断和检疫。2规范性引用文件
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下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然·鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GI34789.28--1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3初步诊断
根据典型症状和病变，以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌，可初步诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定。
3.1症状
3.1. 1急性型症状
最初山现禽群中··些禽只突然死亡·随后即山现另外禽只发热、厌食、抑郁、流涎、腹湾、羽毛粗乱、呼吸困难、临死前出现发。
3.1.2慢性症状
急性型耐过的或由弱毒菌株感染的禽只可垒慢性型病程，其特征为局部感染，在关节、趾垫、腱鞘、胸骨粘液囊、眼结膜、肉垂、喉肺、气囊、中耳、骨髓、脑膜等部位星现纤维素性化脓性渗出、坏死或不间程度的纤维化。
3.2病理变化
急性型的病变主要是被动性充血、出血，肝、脾肿大和局灶性坏死，肺炎、腹腔和心包液增多。慢性型主要局灶部纤维素化脓性渗出、坏死和纤维化3.3病料涂片检菌
3.3.1抹片的制备
用镊子夹持病变组织肝或脾·然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层；若取液，扭灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块，用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层，
3.3.2干燥
自然于燥。
3.3.3固定
将十燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精火焰上来叫通过数次，略作加热进行固定。3.3.4革兰氏染色法
固定好的抹片1.滴加草酸铵结晶紫色液，染色2min→水洗→加革氏碘溶液于抹片t媒染2min*水洗加95％洒精于抹片上脱色1min-→水洗加稀释碳酸复红复染s0）s水洗-→吸-+镜检。本507
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病原体为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌.菌体大小为0.2μm~0.4μm×0.6 um~~2.5μm.单个或成对存在，常有荚膜。
3.3.5其他染色法
甲醇固定.按GB4789.28--1994中2.6或2.1规定进行，瑞特氏或美蓝染色星两极浓染的菌体。4病原分离和鉴定
4.1病原分离
4.1.1病料的采集
4.1.1.1最急性和急性病例可采集死亡禽只的肝、脾、心血；慢性病例一般采集局部病灶组织；对不新鲜或巴被污染的样品，可自骨髓中采取病料。采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插人组织或心血内取样。4.1.1.2如果为活禽，可通过鼻孔挤出粘液.或将棉拭子插入鼻裂中取样。4.1.2培养基制备
5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基·配制方法见附录A。4.1.3动物接种
如架病料污染严重，则可将0.2ml碾碎的病料，经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡，接种动物在24h～48h内死亡，可以从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。4.1.4培养
将病料接种于5%鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂（见第A,1章）、鲜血琼脂培养基（见第A.2章）在35（37（下培养，经18h～~24h培养后菌落直径为1mm~~3mm.菌落呈散在、圆形，表面起呈奶滴状。
4.2病原鉴定
4.2.1培养特性
为兼性厌气菌，生长最适温度为35（~37（.经18h~24h培养后，菌落自径为1mm~3mm，呈散在的圆形凸起和奶油状.有荚膜菌落稍大。4.2.2镜检
从菌落上挑取少量涂片，干燥，固定、染色、镜检间3.3.2~~3.3.5。4.2.3生化鉴定
鉴定方法如下：
a）接种于葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气·接种于鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、亦藓糖、戊五醇、M肌醇、水杨苷发酵管不发酵。糖发酵管按G134789.28-1994中3.2规定配制。h）接种丁蛋白陈水培养基中，可产生吲哚。试验按（B4789.28-19943.13规定的方法操作。鲜血液琼脂上不产生溶血。操作方法按GB4789.28一1994中4.6规定进行。c）
d）麦康凯琼脂上不生长。麦康凯琼脂按GB4789.28-1994中4.24规定配制。能产牛过氧化酶（方法按GB1789.28-1994中3.20规定进行）、氧化酶（方法按e
（B4789.28·1994中3.18规定进行）.但不能产生尿素酶（方法按G4789.28--1994中3.15规定进行）、3-半乳糖替酶（方法按GB4789.28-1994中3.3规定进行）。「）维培（VP)试验为阴性。试验按GB4789.281994中3.4规定方法进行。4.2.4动物接种试验
细菌纯培养物稀释后.以100个细菌经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡·接种动物在24h~~48h内死亡，并可以从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。4.3结果判定
依据病原分离培养特性、生化鉴定、动物接种试验川作出确切诊断，5琼脂扩散试验（用于监测免疫效果和追溯性诊断）5.1材料准备
5.1.1禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清和标准阴性血清.按说明书使用。NY/T563-2002
5.1.2溶液配制：1%硫柳求溶液、pH6.4的0.01mol/I.磷酸盐缓冲(PBS)溶液和生理盐水、配制方法见录13。此内容来自标准下载网
5.1.3琼脂板的制备：取pH6.4的0.01mol/l.PBS溶液100ml.放于=角瓶中，加人0.8g～1.0g琼脂糖，8g氯化钠。-角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖等熔化，再加1%硫柳求1ml，冷至45℃~50C时，将洁净T热灭菌直径为90mm的平Ⅲ置于平台上.每个平Ⅲ加人18ml.~20ml。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。5.2操作方法
5.2. 1打孔
在制备的琼脂板上，用直径4mm的打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔辟离为3mm。将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插人，轻轻向左侧方向将琼脂挑出、勿伤边缘，避免琼脂层脱离平血皿底部。5.2.2封底
用酒精灯轻烤平皿底部到琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏5.2.3加样
用微量移液器吸取用灭菌生理盐水（见第B.3章）稀释的抗原悬液滴人中间孔·标准阳性血清分别加人外周的1、4孔中，标准阴性血清（每批样品仅做一次）和受检血清按顺序分别加人外周的2、3.5.6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。5.2.4感作
加样完毕后，静止5min～10min，将平皿轻轻倒置.放人湿盒内置37（温箱中反应，分别在24h和48 h 观察结果。
5.3结果判定
5.3.1判定方法
将琼脂板置H光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现条清晰的白色沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出沉淀线·则试验可成立。5.3.2判定标准
5.3.2.1若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的未端相吻合，则被检血清判为阳性。
5.3.2.2若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一一端在被检血清孔处向抗原孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验，如仍为可疑，则判为阳性。5.3.2.3若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。
5.3.2.4若被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并红伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若仍出现非特异性反应则判为阴性。判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体。
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（规范性附录）
培养基的配制
A.15%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基制备营养琼脂（按（G134789.28-1994中4.7规定配制）3%淀粉溶液
将灭菌的营养琼脂加热熔化，使冷却到50（，加人灭菌的淀粉溶液、葡糖及鸡血清.混勾后，倾注平板。
A.2鲜血琼脂培养基制备
肉没液肉汤（按G34789.28
81994中4.1规定配制）
蛋肉陈
磷酸氢二钾(K,HPO）
氯化钠(NaCI）
灭菌加热熔化，使冷却到50（，加人无菌鸡鲜血达10%，混匀后，倾注平板。S1
B.11%硫柳汞溶液的配制
硫柳求
蒸馏水
溶解后，存放备用。
（规范性附录）
溶液配制
B.2pH6.4的0.01mol/LPBS溶液的配制甲液：
磷酸氧二钠(Na.HPO,·12H,)
加燕馏水至
乙液：
磷酸二氢钾(KH,PO),）
加燕馏水至
待溶解后分别保存。
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用时取甲液24ml.、乙液76ml混合即为100ml.pH6.4的0.01mol/LPBS溶液。3生理盐水的配制
氯化钠(NaCI）
蒸馏水
溶解后，置中性瓶中灭菌后存放备用8.5g
1 000 ml.
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