【农业行业标准(NY)】 禽支原体病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T553—2002
禽支原体病诊断技术
Diagnostic techniques for avian mycoplasmosis(mycoplasma gallisepticum)
2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部
NY/T553—2002
禽支原体病（avianmycoplasmosis）又称鸡败血支原体（mycoplasmgallisepticum，简称MG），常引起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡，引起传染性窦炎。世界动物卫生组织Lworld Organizationfor Animal Health（英）,Office Internationaldes Epizooties（法）,OIE］将本病例B类动物疫病，我国将其列为二类疫病。
本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。本标准的附录A为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准起草人：郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。422
1范围
禽支原体病诊断技术
本标准规定了禽支原体（MG）分离鉴定和快速血清凝集试验（RSA)的技术要求。本标推适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。2禽支原体的分离和鉴定
2.1材料准备
2.1.1培养基制备见附录A（规范性附录）。2.1.2免抗MG阳性清和抗兔荧光抗体结合物。2.2分离
2.2.1采样
NY/T 553—2002
活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。2.2.2样品的处理
采样后应尽快培养。如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。
2.2.3接种
将样品0.2mL接种于1.8mL支原体液体培养基中，依次10倍稀释至10-3，密封，37℃培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳（CO2)培养箱中培养。2.2.3.1每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现pH值变化，立即接种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化，每隔3d~5d盲传-代，共传3代，培养10d后接种于固体培养基上培养。2.2.3.2固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察菌落，可见中央突起呈荷包蛋样（有时不典型),需进一步作血清学鉴定。
2.3鉴定
2.3.1用间接荧光抗体试验（IFA)鉴定MG。取1.0cm～1.5cm的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落（S.或R株）、一块已知其他支原体菌落，第二块载玻片上放一一块待检分离物。2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的免抗MG血清，第二块载玻片上琼脂块上加一滴正常兔血清。
2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30min后，分别放到含有磷酸盐缓冲液（PBS)(pH7.2）的不同器Ⅲ中，冲洗10min，共冲洗2次。2.3.4将琼脂块放回原玻片，吸水纸吸取过多的水分，每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物，反应、洗涤同前，最后将琼脂块放回玻片，吸干多余水分后于入射式荧光显微镜下检查结果。2.4结果判定
菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应，若仅有暗淡的菌落轮廓，与背景荧光颜色差别不大为阴性。其他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性；第一块载玻片分离物、与已知MG菌落为阳性结果时，证明分离物为鸡毒支原体。423
NY/T553-2002
3快速血清凝集试验（RSA)
3.1从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应4℃保存，不能冻结。3.2试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。3.3操作方法：室温中加一滴（20μL）血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用棉签或火柴棒将其混合，轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。3.4结果判定：室温条件下，56℃30min处理后的鸡血清2min内，火鸡血清3min内判定结果。规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集，或超过2min（火鸡3min）在边缘出现凝集，判为可疑。超过规定时间无凝集者，判为阴性。424
A.1支原体肉汤培养基
附录A
（规范性附录）
支原体培养基的制备
NY/T553—2002
A.1.1新鲜酵母浸出液的制备：称取250g具有活性的鲜酵母，悬浮于1000mL蒸馏水中，加热至沸点，冷却。3000r/min离心20min，倾出上清液，用0.1mol/L氢氧化钠（NaOH)调pH至7.8~8.0。过滤除菌，置4℃保存备用。
A.1.2甲液：不含结晶紫的支原体（PPLO)肉汤培养基(Difco)14.7g，加蒸馏水或去离子水700mL。A.1.3乙液：猪血清（56℃灭活30min）150mL，质量浓度为25%新鲜酵母浸出液100mL，质量浓度为10%葡萄糖溶液10mL，质量浓度为5%乙酸铊10mL，200000IU/mL青霉素G5mL，质量浓度为0.1%酚红2mL。将以上各种成品混合即乙液（也可用犊牛血清或马血清代替猪血清）。将甲液经121kPa灭菌15min，冷却后加人乙液调pH值至7.8，即为支原体肉汤培养基。A.2支原体固体培养基www.bzxz.net
取不含支原体生长抑制物的纯琼脂10g，加入到上述甲液中，混合后如前所述高压灭菌，置56C水浴中。然后加人乙液，小心混勾，避免产生气泡，然后倒人平血中厚度约0.4cm，冷却后备用。425
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