【国家标准(GB)】 饲料中沙门氏菌的检测方法

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T130912002
代警G13/T13091—-1991
饲料中沙门氏菌的检测方法
Determination of Salmonella in feeds(1SO 6579:1993,MicrobiologyGeneral guidance onmethods for the detection of Salmonella,MOD)2002-09-24 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总周
2003-03-01实施
050928075217
中华人民共租
国家标准
饲料中沙门氏菌的捡测方法
GB/T 13091—2002
中国标准出版社出版
北京复兴门外二里河北街16号
邮政编码：100045
电话：6852394668517548
中国标准出版社素皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行
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开本 880X1230 1/16
字数 34 干字
2003年4月第一版
反2003年4月第一次印刷
印数1—1500
书凸：155066：1-19203
定价13.00 元
网址 bzcbs.com
科日 634-493
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举报电话：（010)68533533
GB/T 130912002
本标准代替（13/T13091—1991《饲料中沙门氏菌的检验方法》.因为国际上的发展原标准在技术[:包过时。
本标准修改采用IS0）6579：1993《微生物学沙门氏菌检验导则》（英文版）。本标准根据1SO6579：1993重新起草。除增加了资料性附录D.附录E外，本国家标准章条编号与1SO6579：1993完全一样。
考惠到我国国情，在采用1S）6579：1993时，本标准做了·些修改。有关技术性差异已编入正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录E给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。
为使于使用，本标准还做了以下编辑性修改：a）“本国际标准”一词改为“本标准”；b）用小数点\，\代替作为小数点的遵号\，\；t）删除国际标准的前言：
d）标推名称由“微生物学钞门氏菌检验导则”改为\饲料中沙门菌的检测方法”。本标准的附录 A,附录 B,附录 C 为规范性附录,附录 D、附录 F 为资料性附录。本标推由全国简料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料下业标准化技术委员会归口。本标推起萨单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）。本标推主要起草人：饶正华、李丽蓓、高生、杨曙明、苏晓鸥。本标雅所代替标雅的历次版本发布情说为：GB/T13091：1991，1
饲料中沙门氏菌的检测方法
GB/T13091—2002
警告：为保障实验室人员的健康，只有具备适当设备的实验室才能承担沙门氏菌检验。应小心处理所有培养材料的废弃物。
1范围
本标准规定了沙门氏菌检验方法本标准适用于饲料中沙门氏菌的检验2规范性引用文件
下列文件中的条款适过标准的引用而成为本标准的条款。凡是日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789.1
GB/T14699
3术语和定义
下列术语和
沙门氏菌
青生微生物学检验
饲料采样方法
适用于本标准。
Salrmonella
检验中，能在选择性固体培养基中形成典型菌落，且生化和血清学鉴定与本标准中描述致的微生物。
沙门氏菌的检！
detection of Salmonella
按本标准检验以确定沙门氏菌在某种产品中存在与否的过程。4原理
个连续的阶段（见附录A）。
沙门氏菌的检测需要！
注：样品中可能存在少量的沙眠菌但却含有大量肠杆菌科的其他菌，因此，选摔性增菌是必锁的：而目，为了检验受伤的沙门氏菌，常须进行预增菌4.1用非选择性液体培养基预增菌将试料接种到缓冲蛋白陈水，在36C=1℃下培养16h~20h。4.2在选择性液体培养基上增菌
将4.1中的培养物接种到氯化镁-孔雀绿培养基和亚硒酸盐胱氨酸培养基中。氯化镁-孔雀绿培养基在42C培养24h，亚硒酸盐胱氨酸培养基在36C土1C培养24h或再延长24h.
4.3划线及识别
将4.2的培养物接种到以下两个选择性培养基：应使用酚红煌绿琼脂培养基，除非国际标准对检样有规定或有特殊考虑（如分离乳糖阳性沙门氏菌）。
GH/T 13091 2002
一.-DHI.琼脂培准基（见5.2.4.2）在36C士1C培养，24 h后检查，必要时培养至48h.根据菌落特性，辨剂可凝菌落。4.4鉴定
挑出4.3中的可疑沙门氏菌菌落，再次培养,用合适的生化和血清学试验进行鉴定。5培养基,试剂和血清
5.1总则
微生物实验室的操作：按照G34789.1进行。5.2培养基和试剂
法：由上有太量的培养基和试剂可供选择,为明确起见,在附录B中规定了它们的成分和制备方法。除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5-2.1缓冲蛋白陈水(BP):见第B.1章。5.2.2氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）:见第B.2章。5.2. 3亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC):见第 B. 3 章。5.2.4选择性划线固体培养基：
酚红、爆绿琼脂：见第 13. 4 章和附录 C℃。a
b）DHI.琼脂:见第B.5章。
营养琼脂：见第B.6章。
三糖铁琼脂(TSI);见第 B.7章。尿素琼脂：见第.8章。
赖氨酸脱羧试验培养基;见第 I3. 9章。5. 2. 9 P-半乳糖苷酶试剂: 见第 [3. 12 章。5.2.10
V-P反应培养基（见第B.10竟）：a)
V-H培养基。
肌酸溶液。
α-萘酚乙醇溶筱。
氮氧化钾溶被，
靛堪质反应培养翡（见第B.章）：胰蛋白陈色氨酸培养基。
柯凡克试剂，
半围体养琼脂：见第B.13章。
盐水溶液：见第B.14章。
5.2. 14沙门氏菌因子0,Vi,H型恤清，6设备与材料
让3：可以用一次性使用的仪器代替可重复使用的假器6.1高灭茵锅或火菌箱。
6.2于热灭菌箱37C±) C-~55C上1 C6.3培养箱:36±1r
6.442C±1C水浴或42C±0.5C培养箱。6.5 水浴;45C+1C,55C+1C.70℃+1C,6.6 水浴:36C11℃
6.7接种环：铂铱或镍铬丝，直径约3mm2
6.9培养瓶或三角瓶，
注：可用无毒余属或朔料螺丝盖的培养瓶或三角瓶。6. 10培养试管：直径 8 mm,长度 1t0 mm。6.11量筒。
6. 12 刻度吸管。
6.13乎血：Ⅲ底直径9cm或11m：7采样
GB/T13091—2002
实验室样品真实、具有代表性，在运输和行过程中没有发生损失或改变是非常重要的。采释方法可按照国家标准GB/T14699.1进行（器其要经过消毒）。8试样的制备
将至少2kg具有代表性的饲料样品，四分法缩分至约250g，过40筛，在密闭瓶中低温保存。9操作步骤(见附录)
9.1试料和1：10稀释液制备
9.1.1用预增菌液(5.2.1)作为稀释液，来制备1110稀释液。9.1.2取试料25 g-加入装有225 ml.缓冲蛋白陈水(5.2.1)的 500 mL广口瓶内，如果试料量不是25g，试料质量与预增菌液的体积比应约为1：10。注1：斯检测来回一特定样品的老个试料时,若有证据表明试料混合不影响羧物结果，试料可以混合。例如：若需检测10份25*试料时,混合这13份，形放250g试料,冲蛋白陈水用22501.：或者从10个单独的试料预增幽被中分别取出0. 1 mL和1 mL人RV 培养基和亚砸酸带胱氨鞍增菌波,混合后分别接入(. I L利I 选择性增菌培养基中。
注2：干样和粉状样可能需要特殊的水合过程以提高沙门氏菌的复性，9.2非选择性增菌
将增菌液在 36 C:±[ C培养,时间不少于 16 h,不超过 20 h。9. 3选择性增菌培养
9.3.1取9.2获得的预增菌培养物们.1ml.，接和手装有10ml.氧氯化镁·孔雀绿增菌薇（.2.2的试管中，另取增菌培养物10mL.接种于装有100)mL业硒酸盐胱氨酸增菌液(5.2.3)培养瓶巾。9.3.2接种后两种培养基9.3.1)的培养条件始下：a！氯化镁孔雀绿增菌液试管在42C培荞荠24h，b）亚酸盐胱氨酸培养瓶在 36C:±1培养24 h 或48 h。注：在某些情况下可以将亚龄盐胱氨酸培养基的培养温度增加至42（：。但需在控验报告中提及此改动。9.4分离培养和鉴定
9.4.1氮化镁-孔雀缘增菌液在培养24h后，分别用接种环划线接种在酚红煌绿琼脂.5.2.1a)半而和[DIII.琼脂5.2.4 b)力乎血上，为取得明显的单个菌落，取一环培养物接种两个平血，第一个平血接种后，连续在第二个平Ⅲ上划线接种。注：在酚红煌绿琼脂平板上划线时，建设使用以下方法：两个半血用同…-接种环（6.7）：按录卫进行划毁操作；述完个平血：第一个平血接种后，不要烧接种环，位不要换接种环。当仅用一个平血时，划线方法按刚录工中的第：个平血的方法。
9.4.2亚硒酸盐跳氨酸培养瓶在培养24h后重复9,4.1的操作。9.4.3将（9.4.1)和（9.4.2)的平Ⅲ底部向上在36℃士1培养箱巾培养。9.4.4业硒酸热胱氮酸培养基(9.3.2和9.4.3)在培养18h后重复9.4.2和9.4.3GB/T13091—2002
9.4.5培养20h~24h后，检查平血（9.4.3和9.4.4）中是否出现沙门氏菌典型菌落，生长在酚红煌绿琼脂上的沙门氏菌典型菌落，使培养基颜色出粉红变红。9.4.6如生长微弱，或无典型沙门氏菌落出现时，可在36℃土1重新培养18h～24h。再检验平血是否有典型沙门氏菌菌落
注：任何典型或可疑菌落均应进行鉴定（9.5）。辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同，此时，可用沙门氏菌多价因子血清，先与菌落作凝集反应，以帮助辨别可疑菌落。
9.4.7在进行沙门氏菌鉴定时，可以使用商业鉴定材料。9.5鉴定
9.5.1鉴定菌落的选择
从每种分离平血培养基上（9.4.和9.4.6）.挑取5个被认为可疑菌落，少于5个时，可将全部典型或可疑菌落供进行鉴定。
挑选的菌落在营养琼脂半血525）上划线培养，在36C土1（培养18h～24h，用纯培养物作生化和血清鉴定。
9.5.2生化鉴定
将按9.5.1挑选的典型值落，用接种针接种在9.5.2.1~9.5.2.6培养量上。9.5.2.1三糖铁培养基(52.6)
在琼脂斜面上划线和穿刺，在36C土1C培养24h。培养基变化见表1。表1三糖铁培养基变化表
培养基部
琼脂斜面
琼脂深部
培养基变化
乳糖和薰糖阳性（利用乳糖或薰糖）红色或不变色乳糖和蔗糖阴性（不利用乳糖和薰糖）底端黄色
葡萄糖阳性（发酵葡萄糖）
红色或不变色葡萄糖阴性（不发酵散萄糖）穿刺膳色
气泡或裂缝
形成硫化氢
葡萄糖产气
典型沙门氏菌培养物，金面显红色（碱性），底端显黄色（酸），有气体产生，有90形成硫化氢（琼胎变黑）。
当分离到乳糖阳性沙门窗时，三糖铁斜面是黄色的，因而证实沙门氏菌，不应仅仅限于三糖铁培养的结果（9.5.3）。
9.5.2.2尿素琼脂培养基（5.2
在琼脂表面划线，在36C士1培养24h，应随时检查，如反应是阳性，尿素极快地释放氨，它使酚红的颜色变成玫瑰红色至桃红色，以后再变成深粉红色，反应常在2h24h之间出现。9.5.2.3L-赖氨酸脱羧反应培养基（5.2.8）将培养物刚好接种在液体表面之下，在36℃土1℃培养24h，生长后产生紫色，表明是阳性反应。9.5.2.4检查3-半乳糖苷酶的反应（5.2.9）取一接种环可疑菌落，悬浮于装有0.25mL生理盐水的试管中，加甲苯1滴，振摇混勾，将试管在36C11C水浴锅中放置数分钟，加OVPG试液0.25mL，将试管重新放入36C土1C水浴锅中24h，随时检查，黄色表明为阳性反应，反应常在20 min后明显出现。9.5.2.5V-P反应培养基(5.2.10)挑取一环可疑菌落，接种在V-P反应培养基5.2.10a)1，在36C士1C培养24h，取培养物0.2mL于灭菌试管中，加肌酸溶液[5.2.10b）~2滴，充分混匀后加α-萘酚乙醇(5.2.10c）]溶液3滴，12002
GB/T13091
充分混勾后再加氢氧化钾溶液5.2.10d)]2滴，再充分振摇混勾，在15min内，形成桃红色，表明为阳性反应。
9.5.2.6靛基质反应培养基（5.2.11）取可疑菌落，接种丁装有5mL胰蛋白陈色氨酸培养基(5.2.11a)]的试管中.在36℃—1℃培养21h,培养结束后，加柯凡克试剂5.2.11b)1mL，形成红色，表明是阳性反应。9.5.2.7生化试验
生化试验见表2。
表2生化试验表
可疑菌在培养基上的反应
三糖铁葡萄糖形成酸
二糖铁葡萄糖产气
二糖铁乳糖
三糖铁燕糖
三糖铁硫化氢（）
尿素分角
赖氨酸脱发
B半乳糖首酶反应
V-P真
（伤美沙门氏菌）不产气
Salmonellatyphi
沙门氏菌亚属
附性或阳性
出现此反应者沙门氏菌株古分率100
巫利桑那属）乳糖反应可阴可阳，但β半乳糖苷酶反应总是阳性的。沙门氏菌亚属1乳糖乳糖苗反应阳性。对这些菌株，可补充生化试验。反应阴性，3半免费标准下载网bzxz
Salmonella paraty
9.5.3血清学鉴定
（甲型副伤寒沙门氏菌）赖氨酸脱羧反应阴性以纯培养菌落（9.5用沙门氏菌因子血清O.Vi或H型，用平板凝集法，检查其抗原的存在。9.5.3.1除去能自凝的菌校
在仔细擦净的玻璃板上
1滴盐水（5.2.13），使部分被检菌落分散于盐水中均勾混合后，轻轻摇动30s～60s，对着黑的背景观察，如果细菌已凝集成或多或少的清晰单位，此菌株被认为能白凝，不宜提供作抗原鉴定。
9.5.3.20抗原检查
用认为无自凝力的纯菌落，按9.5.31方法，用1滴0型清（5.2.14)代替盐水，如发生凝集，判为阳性。
9.5.3.3Vi抗原检查
用认为无白凝力的纯菌落，按9.5.3.1方法.用1滴Vi型血清（5.2.14）代替盐水，如发生凝集，判为阳性。
9.5.3.4H抗原检查
用认为无自凝力的纯菌落接种在半固体营养琼脂（5.2.12)中，在36C土1C培养18h～20h，用这种培养物作为检查H抗原用，按照9.5.3.1方法，用1滴H血清（5.2.14)代替盐水，如发生凝集，判为阳性。
9.5.4生化和血清试验综合鉴定
GB/T 13091--2002
表 3 给出广对菌落(9. 5. 1)的鉴定实验[9. 5, 2 和 9. 5. 3)结案。表3生化和血清试验综合鉴定表
生化疫应
无典型反应
无典型反应
9.5.5权威性确认
有无自凝
血清学反应
0,Vi或A抗原阳性
全为棚性反应
未作检查(9.5.3.J)
,Vi或H抗原阳性
全为阴性反应
沙门氏菌可疑菌株（见表3）送专门菌种鉴定中心进行鉴定。10
结果表示
根据分折结果，得出克样品中存在或不存在沙门氏菌，检验报告
检验报告应给出检测方法和结果，应给出在本标雄没有说明的操作条件。说
被认为沙门代菌菌殊
可能是沙门氏菌
可能是沙门氏菌
可能是沙引氏荫
不认为是沙门氏菌
检验报先中地应说明培养温度，以及亚硒酸盐胱氨酸培养基的培养温度是否增加到42。检验报生应包括样品鉴定的所有必须的内容。12精度确认
为检验实验室用本标推中的力法和培养基检测沙门氏菌的能力，可将参考样接人颈增菌培养基(5.2.1)作对照。检测程序与检样相同。:
附录A
（规范性附录）
检验程序图
检验样品 25 g+ 质增菌培荞基（凝冲蛋白陈水)225 mL，在 36℃+1培养 16 h~-20 h
取预增培养物 0. 1 mL 接种于氧化胰-孔希绿增菌被中，在42℃培养24 h中
前红煌绿琼瘤(平血)36C=1℃培养20 h -- 40 b,如有雷要培养至 48 hGB/T 13091—2002
取预增菌培养物 10 tnT。 接种于亚础酸盐胱氨酸增菌减中，在36℃:±1℃培养24h或48hDH琼脂(平血)36C±1℃ 培养 20 h ~ 24 h,如有微要, 培并至 48 h
每乎血取 5 个有沙门氏菌特征的菌落，接种在营养琼脂,上,36°℃±1℃培养18h~24h
生化定
鞘果报告
图A、1：
检验程序图
血鉴定
GB/T130912002
B.1缓冲蛋白陈水
B.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（Na.HPO，·12HO)
磷酸二氢钾（KH,PO）
蒸馏水
附录B
（规范性附录）
培养基和试剂制备
B.1.2制法
按上述成分分配好校正pH，分装于大瓶中，121C高压灭菌20min，临用时分装在500mL瓶中，每瓶225mL，或配好后
安正/pH，分装于500mmL瓶中，每瓶225mL，121C高压灭菌，20min后备用。B.2氯化镁-孔雀绿增菌液
B.2.1溶液A
B.2. 1.1 成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾（KH,PO
蒸馏水
B.2.1.2制法
将各成分加入蒸馏水电如热至约70C溶解。此溶液需当天使用B.2. 2溶液 B
B.2.2.1成分
氯化镁（MgC1，·6H0）
蒸馏水
B.2.2.2制法
将MgClz：6H,O溶于水中。
B.2.3溶液C
B.2.3.1成分
孔雀绿
蒸馏水
B.2.3.2制法
将孔雀绿溶于水中。溶液可室温保存丁棕色玻璃瓶中。B.2.4完全培养基
B.2.4.1成分
溶液A
1000ml
1000mL
1000mL
溶液B
溶液C
B.2.4.2制法
GB/T13091—2002
按F述比例配制，校正pH值，使灭菌后pH值为5.2，分装于试管中，每管10ml.。115C高压灭菌15min。
冰箱保存。
B.3亚硒酸盐胱氨酸增菌液
B.3.1基础液
B.3.1.1成分
胰蛋白陈
磷酸氢二钠（Na,HPO
亚硒酸钠
蒸馏水
B.3.1.2制法
溶解前三种成分
B.3.2L-胱氨酸溶液
B.3.2.1成分
L-胱氨酸
中，煮沸5min，冷却后，加人亚硒酸钠，校正pH后分装，每瓶1000ml。0.1g
1 mol/L氢氙化
B.3.2.2制法
菌水将上述成分稀释到100ml.，册须蒸汽灭菌在灭菌中，用灭
B.3.3完全培养基制备
基础液
L-胱氨酸溶液
基础液冷却后，以无菌操作加L-胱氢酸溶液，将培养基分装于适当容量的灭菌瓶中，每瓶100mL，注：培养基在配制当日使用
B.4酚红、煌绿琼脂
B.4.1基础液
B.4.1.1成分
牛肉浸膏
蛋白陈
酵母浸液粉木
磷酸氢二钠（NaIIPO,）
磷酸二氢钠（NaH,PO)
蒸馏水
B.4.1.2制法
12g~18g
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