【国家标准(GB)】 饲料中细菌总数的测定方法

中华人民共和国国家标准
饲料中细菌总数的测定方法
Method for determination of aerobicbacterial count in feeds
GB13093--91
本标准参照采用国际标准ISO4833—1978《食品和动物饲料中微生物学检验方法》。1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中细菌总数的测定方法。本标准适用于饲料中细菌总数的测定。2原理
将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在30士1℃下培养72士3h，计数平板中长出的菌落数，计算每克试样中的细菌数量。
3仪器、设备
3.1天平：感量为0.1g。
3.2振荡器：往复式。
3.3干热灭菌箱：50～~200±1℃。3.4高压灭菌锅。
3.5冰箱：普通冰箱。
恒温箱：30±1℃。
电炉：可调式。
平皿：直径为9cm。
吸管：容量为1、10mL。
三角烧瓶：容量为250、500mL。玻璃珠。
试管：18×180 mm。
水浴锅：46士1℃。
酒精灯。
试管架。
橡皮乳头。
检验程序
细菌总数的检验程序如下：
国家技术监督局1991-07-16批准174
1992-04-01实施
操作步骤
5.1采样
GB13093--91
做成儿个适当倍数的释液
选择2～3个适宜稀释度，各以1mL量加人灭菌平咀内
每平血内加入适量琼脂
30=1℃
72±3h
菌落计数
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混合。
海运进口饲料采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛饲料超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。5.2试样稀释及培养
5.2.1无菌称取试样10.0g，放入含有90mL稀释液的灭菌三角烧瓶内（瓶内预先加有适当数量的玻璃珠）。经充分振摇，制1：10的均匀稀释液。最好置振荡器中以8000～10000r/min的速度处理2～3min。
5.2.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，作成1：100的稀释液。5.2.3另取一支1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支吸管。
5.2.4根据饲料卫生标准要求或对试样污染程度的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平血内，每个稀释度作两个平血。5.2.5稀释液移入平血后，应及时将凉至46土1℃的平板计数用培养基（可放置46士1℃水浴锅内保温）注入平Ⅲ约15mL，小心转动平Ⅲ使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过15 min。
如估计到试样中所含微生物可能在琼脂平板表面生长时，待琼脂完全凝固后，可在培养基表面倾注175
凉至46土1C的水琼脂培养基4mL。GB1309391
5.2.6待琼脂凝固后，倒置平皿于30士1℃恒温箱内培养72土3h取出，计数平板内菌落数目，菌落数乘以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。5.3菌落计数方法
作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助于放大镜检查，以防遗漏。在计数出各平板菌落数后，求出同一稀释度两个平板菌落的平均数。6菌落计数的报告
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平板菌落数。
6.1稀释度的选择
6.1.1应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。6.1.2如有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，视两者之比如何来决定，如其比值小于2，应报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字。6.1.3如所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.1.4如所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.1.5如所有稀释度均无菌落生长，则以小于（<)1乘以最低稀释倍数报告之。6.1.6如所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.2结果报告
菌落在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。176
GB13093-—91
附录A
稀释液和培养基制备www.bzxz.net
（补充件）
除特殊规定外，本标准所用化学试剂为分析纯；生物制剂为细菌培养用；水为蒸馏水或无离子水。要求在试验条件下，所用试剂应无抑制细菌生长的物质存在。A1稀释液
A1.1成分
氯化钠（GB1266）
蛋白陈
蒸馏水
A1.2制法
1000mL
将上述成分加热溶解，校正pH使其在灭菌后保持7.0士2。按9mL/支分装于试管，90mL/瓶分装于三角烧瓶中，塞上棉塞包扎后121士1℃高压灭菌20min。A2平板计数用培养基
A2.1成分
蛋白陈
酵母漫膏
无水D-葡萄糖
蒸馏水
A2.2制法
1 000 mL
将上述成分加热溶化，校正pH使其在灭菌后保持7.0士2。过滤、分装三角烧瓶中，包扎后121土1℃高压灭菌20min。
A3水琼脂培养基
A3.1成分
蒸馏水
A3.2制法
1000 mL
加热使琼脂溶化，校正pH使其在灭菌后保持7.0土2。分装三角烧瓶中，包扎后121士1℃高压灭菌20 min。
上述稀释液和培养基如不马上使用，应保存在0～5℃下，时间不超过一个月。附加说明：
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由西北农业大学兽医系负责起草。本标准主要起草人王英珍。
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