【国家标准(GB)】 小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA)

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.118--2003
代替GB/T149331994
小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA）
Determination of T-2 toxin in wheat withenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)2003-08-11发布
2004-01-01实施
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
GB/T5009.118—2003
本标准代替GB/T14933—1994《小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法（ELISA)》。本标准与GB/T14933-1994相比主要修改如下：修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定（ELISA）》：一按GB/T20001.4--2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了修改。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：卫生部食品卫生监督检验所。本标准主要起草人：阳传和、罗雪云、计融。原标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。88
1范围
小表麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA)
本标准规定了小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法（ELISA）。本标准适用于小麦及其制品中T-2素的测定。本方法的检出限为1μg/kg。
第一法
间接法
2原理
GB/T5009.118-2003
将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。
3试剂
3.1甲醇。
3.2石油醚。
三氮甲烷。
无水乙醇。
乙酸乙酯。
二甲基甲酰胺。
四甲基联苯胺（TMB)。
吐温-20。
30%过氧化氢（30%H20.）。
3.10抗体：杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。抗原：T-2毒素与载体蛋自-牛血清白蛋白（BSA）的结合物。3.11
免抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（酶标二抗）。3.12
3.13ELISA缓冲液系统。
3.13.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（NazCO），2.93g碳酸氢钠（NaHCO,），加水稀释至1000mL.。3.13.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T）。配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾（KHzPO）),2.9g磷酸氢二钠(Naz2HPO,·12H2O),&.0g氟化钠（NaCI)，0.2g氯化钾（KCI)，0.5mL吐溢-20，加水至1000mL。3.13.3底物绶冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：0.1mol/L柠檬酸（C.H.O，·H，O)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液；0.2mol/L磷酸氢二钠（NaHPO.），即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液；89
GB/T5009.118—2003
取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。3.13.4底物溶液：取50μLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物缓冲液十10μl.30%过氧化氢，混匀。
3.14T-2毒素标准溶液
用甲醇配成1mg/mL，T-2毒素贮备液，一20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。4仪器
所有玻璃器血均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馅水冲洗。4.1酶标检测仪。
4.2酶标板（40孔或96孔）。
4.3电动振荡器。
4.4电热恒温水浴锅。
4.5具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。5分析步骤
5.1提取
称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4十1），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发血中，置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发血中残济，洗人250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4+1）分次洗涤，转人同一分液滑斗中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装人0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加人0.4g活性碳，敲紧）将过柱后的洗脱液倒人蒸发血中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，择干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转人浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并人浓缩瓶中，将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。5.2ELISA检测
5.2.1用T-2-BSA（4μg/mL）包被酶标板，每孔100pL，4℃过夜；5.2.2酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加人不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样中的毒素含量）与抗体溶液的混合液（1十1，每孔100μL，该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备），置37℃1h；5.2.3酶标板洗3次，每次3min后，加人酶标二抗，每孔100μL，37℃1.5h；5.2.4同上述洗涤后，加入底物济液，每孔100μl，37℃30min；5.2.5用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50pL，于450nm处测定吸光度值。6结果计算
按式(1)计算：
式中：
X---T-2浓度，单位为纳克每克（ng/g）；酶标板上所测得的T-2毒素的量（ng），根据标准曲线求得：Vi-—试样提取液的体积，单位为旁升（mL)：90
.（1)
V2—滴加样液的体积，单位为毫升（mL），D—样液的总稀释倍数；
m--试样质量，单位为克（g）。7精密度
GB/T5009.118—2003
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。第二法直接法
8原理
将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加人一定量的酶标记抗体与试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。
9试剂
9.1甲醇。
9.2石油醚。
9.3三氯甲烷。
9.4无水乙醇。
9.5乙酸乙酯。
9.6二甲基甲酰胺。
9.7四甲联苯胺（TMB)。
9.8吐温-20。
9.930%过氧化氢（30%H，02）。9.10抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA)。9.11
9.12ELISA缓冲液系统。
包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（NazCO.）,2.93g碳酸氢钠9.12.1
（NaHCO）加水稀释至1000mL。
9.12.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T)，配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾（KH,PO.）,2.9g磷酸氢二钠（Na,HPO。·12H,O),8.0g氯化钠（NaCI)，0.2g氯化钾（KCI)，0.5mL吐温-20，加水至1000mL。9.12.3底物缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：0.1mo1/L柠檬酸（CHsO，.H.O），即称取19.2g柠檬酸，加水至1000mL，为甲液：0.2mo1/L磷酸氢二钠（NazHPO,），即称取71.7g磷酸氢二钠，加水至1000mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。9.12.4底物溶液：取50μLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液+10mL底物缓冲液十10uL30%过氧化氢，混匀。
9.13T-2毒素标准溶液
用甲醇配制1mg/mLT-2毒素贮备液，一20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。91
GB/T5009.118—2003
10仪器
所有玻璃器血均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。10.1酶标检测仪。
10.2酶标板（40孔或96孔）。
10.3电动振摇器。
10.4电热恒温水浴锅。
10.5具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。11分析步骤
11.1提取
称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氮甲烷-无水乙醇（4+1），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发血中，置90℃水浴上通风摔干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4十1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装人0.5g中性氧化铝，鼓平表面，再加人0.4g活性碳，敲紧）。将过柱后的洗脱液倒人蒸发血中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转人浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。11.2ELSA检测
.11.2.1用T-2-BSA（4μg/mL）包被酶标板，每孔100uL.4℃过夜。11.2.2酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加人不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样囊素含量）与抗体-酶结合物溶液（1+100）的混合液（1+1，每孔100uL，该混舍液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃1.5h。11.2.3酶标板洗3次，每次3min后，加人底物溶液。每孔100μL，37℃30min。11.2.4用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。12结果计算
按式(2)计算：
式中：
T-2浓度，单位为纳克每克（ng/g）X-
-酶标板上所测得的T-2毒素的量（ng),根据标推曲线求得：Vi——试样提取液的体积，单位为毫升（mL)；V，——滴加样液的体积，单位为毫升（mL)；D—样液的总稀释倍数；bzxZ.net
一试样质量，单位为克(g）)。
13精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。92
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