【商检行业标准(SN)】 非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1559.2—2005

非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程

Protocol of indirect immunofluorescent assay for African swine fever

2005-02-17 发布 2005-07-01 实施

中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局  发布

前言

本标准参照了国际动物卫生组织(OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》(2004 年版)关于非洲猪瘟诊断中的间接免疫荧光抗体试验方法。

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局负责起草。

本标准主要起草人：刘中勇、周仲芳、许如苏、游洪。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程

1 范围

本标准规定了间接免疫荧光试验检测非洲猪瘟抗体的方法。

本标准适用于非洲猪瘟抗体的检测。

2 仪器设备

2.1 荧光显微镜。

2.2 倒置显微镜。

2.3 二氧化碳培养箱和普通恒温培养箱。

2.4 冰箱。

3 试验材料

3.1 非洲猪瘟标准毒株。

3.2 非洲猪瘟标准阳性血清和阴性血清。

3.3 抗猪荧光抗体。

3.4 PK-15细胞（猪肾细胞）或 Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）。

3.5 胎牛血清。

3.6 被检血清：56℃灭活 30 min。

3.7 蒸馏水（pH 7.4），配制方法参见附录 A。

3.8 细胞基础培养液、细胞生长培养液和细胞维持液，配制方法参见附录 A。

3.9 0.01 mol/L pH 7.4 PBS（磷酸盐缓冲液），配制方法参见附录 A。

3.10 缓冲甘油：使用中性太白自发光的甘油（分析纯）配制，配制方法参见附录 A。

3.11 丙酮：使用前置冰箱预冷。

4 操作方法

4.1 病毒培养

用细胞生长培养液 PK-15 细胞或 Vero 细胞，待细胞长成单层后，弃去培养液，加入非洲猪瘟标准毒株，使病毒液刚好完全覆盖细胞。于37℃ 5%二氧化碳培养箱中吸附 0.5 h～2 h，弃去病毒液，换以新鲜的细胞维持液，置于37℃ 5%二氧化碳培养箱内培养，逐日观察，待80%以上细胞出现 CPE（细胞病变）时收获。同时培养未感染病毒的细胞，供对照使用。

4.2 制备抗原片

将收获的非洲猪瘟病毒感染组织细胞配制成浓度为 5×10⁶/mL的细胞悬液，滴2～3滴于载玻片上，涂成均匀薄片，室温下自然风干，用预冷丙酮固定 10 min后，制成抗原片。置-20℃保存。

4.3 制备细胞对照片

将长成单层细胞的 PK-15 细胞或 Vero 细胞按 4.2的方法制备成细胞对照片。

4.4 加样

用PBS将被检血清作1∶10稀释后，取适量加上抗原片和细胞对照片上，分别制成待测标本和细胞对照标本。将标本放入湿盒内，置于37℃恒温培养箱内温育 1 h。