【团体标准】 蛋白酶活力测定法

备案号：2744-1999
中华人民共和国行业标准
蛋白酶活力测定法
SBT109071000
去代替7BX66030-87
Measureuent of proteinaseactivity本方法适用于酿游酱油时在制品菌种、成曲的蛋白活力测定。1福林法
1.1，诚剂及溶液：以下试刻都为分析纯1.1、1称试剂（Folin试剂）：于2000ml，廉口回流装贯内加入钨酸销（Na，WO，2H0）100g酸钠（NaMo0，·2H.0）25g，蒸馅水700mL，名5%磷酸50ml、浓盐酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂（Li,S0）50g+蒸水50mL，混，加入几滴波休很，冉煮沸15min，以驱送残浣及除去颜色，溶滋应呈黄色而非绿色。容落滤仍缘色，需要再儿滴兜液，冉志沸除去之。冷却后，烂容至1000mL，用细菌满斗（No4~5）过，置于棕色瓶中保存，此落浓史用时加2倍蒸增水稀释。即城已稀弹的福林试剃。11.20.4mo1碳酸钠落液：称取无水碳酸钠（Va20a）42.4g+定容至1000mL1.1.30.4mol=氮乙酸（TCA）溶腋：弥取=氯乙酸（CCL，C0OH）63.4g、定至1000ml.。1-1.4PH7.2磷酸热缓冲液：称取磷二氢钠（NaH,P0，·2H,0）31.2g，定容至I000mL，即成0.2unpl落液（A），称取磷氧：钠(NHP0，12H.O）71.63g，定容至1CC0mL，即成0.2mml落液（B液）。
胶A液28ml和滚72ml，再用恭馅水部释1倍：即0.1alpH72的逐酸盐冲液。1.1.52%酪蛋内溶液：准确称取干酪素2%，准至0.002g，加入0.氢氧化销10mL在水浴中加热使溶解（必要时而小火加热点诺），然后用pH7.2裤酸缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或效入冰箱内保存，否则极易殖细菌，引起变质，1.1.6100g/mL酪氮酸溶液：精确称取在105烘箱中烘至值重的酪氛整0.1000g，逐步加入6mL1.V益酸便溶解，用0.2N盐酸定容至100m山，其浓度为10g/mL，再吸取此坡10m山，以0.2N盐酸定容至100ml.，即配成100B/mL的酪氧硬落滚。此格液配成后也应及时便用或效入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质
1.2仪器
9.分析天平，感量0.1mg
b.581-G型光电比色计7型分光光度动c.水溶锅；
d.1、2、5、100mL移液替等.
1.3操作
国家国内资易局1599-04-15批准1599-04-15实施
1.3.1标谁曲线的绘制
303171000
1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氮酸溶液（表1)。1配制各种不同浓度的酷氨酸溶液剂
然增水，L
[00ug/m醇要酸，ml
略点酸最终侬度.2/rul
1.3.1.2谢定丧骤：取6支试管编导接表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL：各加入0.4liiol磁酸钠5mL，再各加入L帮秤的福林试剂1ml，摇匀置T水浴锅中。40C保迟发色20min在581一G型光电比包计上分别测定光密度（0F）（滤色片用65*）或用72型分光光度计进行测定（被长660nm）。没测三改，取平均值，将1-6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（蒸馅水空白试验）账题得的光密度为净数。
为了满楚范见，再列出表格如下（表2）。表2
按在1制备的不减浓出酪或醛，mLn.4mol/LNa.co.ml
码林试剂，
以净D值为横坐标，氨酸的液度为纵坐标，给制成标准出线（或可求出每度（D所相当的醛氨酸量K)。
1.3.2样品稀释液的制备。
1.3.2.1测定随制剂：称取酶粉0.100g，加入PH7.2磷碎酸盐缓冲液定容全100mL，吸取此液5mL，再鹿缓冲波稀释至25mL，即成5000倍的酶粉稀释液1.3.2.2测定成曲酸，称取充分研继的成曲5x，加水至1cCmL、在401水溶内间断搅祥1h：过滤，滤液用0.ImolpH7.2磷酸盐短冲液稀轻到-定倍数（估计醇活力而定）。1.3.3样品避定：取15×100mm试管3支，缩号1、2、3（做2只也可）：每管内切入伴品稀糕液1mL，置于0C水浴巾预热2min，再各加入经同拌预热的酪蛋有1ml，精确保湿1omin，时间到片，立即再各加入0.4mol三氯之酸2mL，以终上反应，继缕置十水浴中保温20min，使余蛋白质沉淀万心或过滤，然后判取1×150ml试管3支，编号1，2、3，每旁内加入滤液1nL：冉加0.4mol碳酸钠5mL，已稀耗的癌林试剂1L摇勾，40Y保温发色20umim后进行光密度（OD）测定。SB/T10317-1
空口诚验也取试管3支，编号（1）、（2）、（3），测定方法向上，硅在加酪蛋白之前先加0.4m1ol氯乙酸2mL、使醇失活，再加人酷蛋白。为了清楚起见，分别列出表格了下，（见表3及表4），表3
均格，usI.
预热2%整益白、ml.
作月10mia（情确比时）
4mDl三瓶乙段，l
滤流，mt.
0molNscOml
相林试剂，I.
平均OD值
净OD值
预热酶浓+nL
U.4tnol=乙酸、ml
作州10mi（精确计时）
项热2%酶蛋白、ml
样品的平均光密度（()D）一空白的平均光密度（OD）=净OD值1.4计算
在40C下每分钾水解酪蛋白产生1酪寂酸定义为1个蛋白磁活力单位，管
样品蛋户酶活力单位（于基）
一由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氢醛微克数（或OD值×K）：式中：A-
一4旁升反应液取出1ml.测定（即1倍）d
N-酶液稀释的倍数
1.5注意事项
反应10min
样品水分百分含量。
以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶《pH7.2）若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶，则把配制酪蛋白溶液和帮耗酸滋用的PH缓冲液换成相应H缓冲液即可。现把七种常用PH级冲液配方提供如下：
1.5.1pH7.5磷酸盐冲波(0.02mol/L)弥取磷酸二钠（NaHP）
5g以蒸筑水溶
释定容至1000ml，
BB/T10817-1900
1.5.2pHz.=乳酸乳钠缓冲液（n.n3molA滤：弱取80%~00%乳酸13.hg，加蒸馅水稀率定容至1000ml。B液：称取70%乳酸钠16g，如水希释定容至1u00mL取A液16mL与3液1ml.混合报移倍印底，1.5.3PH3.0乳酸乳酸钠缓浓液(U.0mol)A液，款取80%90%乳1，5g，以水定容至000ml。B液：称取70%乳酸钠16g+蒸馏水溶解定容至100ml.。取A液SmL与B凌1mL，混分稀释倍即成.1.5.4PFI1>硼砂一氢氧化钠缓冲液A报：称取痧19.8k：用蒸通水溶解定容至10K00mL（(l05mol），R液：称取氨氧化钠8g，用蒸增水溶解定容至10r:0ml.（0.2N)。取A液250al.+B液215ml混合，用蒸馅永稀释定穿至10%0ml.即成。1.5.5pH11.0翻砂一氧载化钠绥冲被A液：称取硼秒19.08，用蒸锅水定容允1000ml.。B液：称取氢氧化钠4z，用举增水定容至1C00mL。取A液与B液等量合。
1.5.62%醋蛋白滤配必酸性时，领先加数滴浓乳酸，使之湿润以斯速其溶解，2甲酥法
成曲蛋内秘活力的测定，如用福林法测定确有困难时，可用中难决测定作过滤。2.1仅器
总、分析大平：感卓0.01g
b.水浴销F
c，电烘箱；
d.夺量瓶、吸管、滴定管等，
2.2试剂与溶液
a.1%酯酸指示剂；
L.0.1%磨香草蓝：
心D.1N氢氧化纳液、甲醚（试剂配制法同氮苯态氮的测定，见GB/5009.391996氨基参题测定法。
2.3操作
2.3.1目测法
称取研细均勾的成曲样品10g，放人2:U元aJ.锥形瓶中，加55温水30mL，充分据勾，置于55C水浴锅中保温3h，取出后加热煮沸以破坏醇活力，冷剂后定容至100m，充分择勾后以脱脂棉过满，吸联滤液10，移至150ml.谁形瓶中，加水5Eml.，1%酚酰指示剂0.2mL，以0.1N氢钒化钠标准溶波滴定至刚显微红色（pH8.2）记下滴定数作为总酸：继续加巾醛10mL，用0.1N氢氧化钠浓滴定至深红色（pH8.5）为终点，若再加香草酚蓝1mL性指示剂，则滴紫红色为终点。记下滴定数，减去空白数后比算成氮基态氮。另称取曲1D做水分，再折算成十基数。232酸按计法
：所用仪器、药品，操作方法等与氨幕态测定伙同（见GB/5009.39-196）。24计算
S81097-1088
蛋白酶活力（克氮基态氮/10）（下基）V.）xNX0.014
式中，V加驾氧化钠标准波滴定数，mL，Vn.—中醛空白滴定数，mL
一曲水分.%，
氧氧化钠标准紊液的当量数，
附加说明：
氮的意克当数。
本标准由国家国内贸易局提出，本标准由上海市造科学研究所凝草、本标准主要起草人须凤高。
+本法实质上在一定湿谨不，一定间内，成曲利用自身的白酸把身原料中的强败水解性效基献，以测定效基效的量来量实白两适力的教位、在培养和境放过理，环境阻战即自牙合有水分。战口有沙蓝知茎能尘高，为了能和辐袜次能酵俩力进行对限，可用空白试理以抑降此误茎、方法是只家一面式丁开对时甲将成曲能新录求，其余换作步完全扭同，能的方决尽把，意靠的然施本7化低入来力中，开当上进把此典族意费分饮：其会换作与择品可：带和甲醛的空户一此单盛K