【SN商检标准】 进境牛、羊包虫病检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3903-2014
进境牛、羊包虫病检疫技术规范Quarantine protocol for echinococcosis of entry cattle, sheep and goats2014-04-09发布
2014-11-01实施
中华人民共利国
国家质量监督检验检疫总周
本标准按照（B/T1.1—2009给出的规则起节。言
SN/T3903--2014
本标修改采用国际动物卫生组织（0IE)编写的&陆生动物疾病诊断于册》（2010版）中2.01.04Echinococcosis/Hydatidosis 中牛羊包虫病部分的有关内容制定而成。本标山国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、肯海出人境检验检疫局。本标雄主要起草人：吴绍强、王彩霞、赵青、林祥梅、刘建、邓俊花。1范围
进境牛、羊包虫病检疫技术规范SN/T3903—2014
本标准规定了进境牛，羊包虫病检疫时的形态学鉴定、组织病理学鉴定，FI.ISA检测以及PCR检测的技术规范。
本标准适用于进境牛、羊等动物及其产品中包虫（即细粒棘球嫩)的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单)适用丁本文件。SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
过碘酸希夫反应periodic-acid-Schiffreaction;PAS糖被强氧化剂过碘酸氧化后，形成多醛。多醛再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合，形成紫红色产物。在结缔组织中出现PAS阳性的无细胞堆积层即为棘球蚜，4临床诊断
牛羊在轻度感染感染初期通常无明显症状，严重感染时表现被毛逆立，消瘦，发育不良。寄生肺部时有明显咳嗽，寄生在肝脏可起消化不良等症状，但一般临床症状不明显。5实验室检测
组织病理学鉴定
5.1.1部检
细粒恢球蝴主要寄生于牛或羊的肝，肺等部位，用手触诊或者部开组织时可发现包囊。如在垂内或育囊中发现原头节即可确诊为棘球坳。如结构不清，可进一步采用过碘酸希夫反应(PAS)进行确诊。5,1,2形态学检查
细粒棘球蜘为包瘫状构造，直径5 c:rm～10 cm,最大可达30 ctn,囊内充满淡黄色液体,可生成内源性子囊以及原头蝴。原头蝴顶突上有两排小筠，钩的大小不同,第--排长22 μm~-45 μm,第二排长18 μm~-38μm（参见附录A)
检获的可疑包囊组织用4%甲醛固定，并采用过碘酸希夫反成进行确诊。1
SN/T3903—2014
5.1.3
3过碘酸希夫反应（PAS）
5.1.3.1
主要试剂与设备
5.1.3.1.1
5.1.3.1.2
5.1.3.1.3
5.1.3.1.4
5.1.3.1.5
高碘酸溶液：配制方法见附录B中B.1。1%淀粉糖化酶溶液：配制方法见B.1Schiff溶液：配制方法见B.1。
亚硫酸氢盐溶液：配制方法见B.1。Harris苏木素染液：配制方法见B.1。切片机。
5.1.3.1.6
5.1.3.1.7
光学显微镜。
5.1.3.2
试验步骤
5.1.3.2.1
切取经过4%甲醛固定的可疑包囊1cm~3cm，用水冲洗后，用浓度分别为35%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度乙醇逐步脱水，根据包囊的大小调整每一步所需的时间（1h~3h），每一步至少1h，100%乙醇需要两次。5.1.3.2.2
经50%无水乙醇+50%二甲苯至少30min后，再用二甲苯透明两次，每次至少30min。经50%二甲苯+50%石蜡至少30min后，再用石蜡浸泡两次，每次至少30min。5.1.3.2.3
5.1.3.2.4
5.1.3.2.5
厚度约4um~6um，用粘片剂固定于洁净的载玻片上烘干。用石蜡包埋，切片，切片
用二甲苯脱蜡10min再用50%无水乙醇+50%三甲苯浸泡5min，然后用浓度分别为100%、95%、85%、70%、50%、35%的梯度乙醇逐步复水。每步约3min~5min，最后置蒸馏水中。5.1.3.2.6试验应设立肝、肺等未感染正常组织对照：待检组织切片用高碘酸溶液处理2min~5min，用蒸馏水充分漂洗；正常组织切片则用1%淀粉糖化酶37℃消化1h，再用蒸馏水漂洗。5.1.3.2.7
mine
室温，Schiff试剂作用15
5.1.3.2.8
5.1.3.2.9
5.1.3.2.10
用亚硫酸氢盐溶液漫3次，每次
2mia
然后流水冲5min再用蒸馏水漂洗1min。用Harris苏木素染液复染10min~15min，然后流水冲5min，再用蒸馏水漂洗1min。用浓度分别为70%.85%、5%、100%的梯度乙醇逐步脱水，再按5.1.3.2.2透明，每步约5 min~10 min。
1用中性树脂封片。
5.1.3.2.11
5.1.3.3结果判断
用光学显微镜观察，当待检组织的胚芽层膜的非细胞堆积层呈紫红色，即PAS阳性反应，经消化的对照组织切片相应部位为PAS阴性反应，即可判定为棘球蜘感染。5.2酶联免疫吸附试验（ELISA)检测5.2.1主要试剂与设备
包被液：磷酸盐缓冲液.配制方法见B.2。5.2.1.1
5.2.1.2洗涤液：0.01mol/LPBST，配制方法见B.2。5.2.1.3
稀释液：含1%的牛血清白蛋白（BSA），配制方法见B.2。5.2.1.4封闭液：含1%BSA，配制方法见B.25.2.1.5
底物溶液：0.05mol/LpH5.0磷酸-柠檬酸，配制方法见B.2。TMB使用液：配制方法见B.2。
5.2.1.6
5.2.1.7
终止液：配制方法见B.2。
-rKAoNiKAca
SN/T3903-2014
5.2.1.8标准抗原和阴阳性血清：牛、羊细粒棘球蝴阳性抗原以及阳性血清、阴性血清，其制备过程见附录C。
5.2.1.9抗体：辣根过氧化物酶标免抗羊抗体和辣根过氧化物酶标免抗牛抗体，其制备过程见附录C。5.2.1.10酶标仪。
5.2.2试验步骤
5.2.2.1以包被液稀释包虫标准抗原至2.5μg/mL，每孔100μL包被96孔ELISA板，4℃过夜。5.2.2.2去除包被液，用300μLPBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人300μL封闭液，室温孵育1h
5.2.2.3弃掉封闭液，300μLPBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人100μL用稀释液1：10稀释的受检牛（羊）血清（受检血清的制备方法见附录C），同时设阳性对照和阴性对照以及复孔（即每个样品设置两个孔），室温孵育1h。5.2.2.4用300pLPBST洗涤5次，每次10mim，拍下。每孔加人100pL用稀释液以1：2000稀释过的辣根过氧化物酶标免抗牛（羊）IgG多克隆抗体，室温孵育1h。5.2.2.5用PBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人100uL.TMB，室温避光孵育15min。5.2.2.6每孔加入100μL1mol/L的H,SO终止显色反应，如果是阳性，颜色由蓝色变为黄色，10min内在490nm波长下读取每孔的吸光值。结果判定
5.2.3
5.2.3.1
实验成立判定
阴性与阳性的临界國值为标准阴性孔平均OD值士（s计算方法见附录D），当标准阳性血清大于标准阴性孔平均OD值十3s时，判定试验成立；否则试验无效.应分析试验失败原因，并重新试验。5.2.3.2结果判定
样品OD值大于标准阴性孔平均OD值+3s时为阳性；小于标准阴性孔平均OD值一3s时为阴性。
当样品OD值介于（标准阴性孔平均OD值一3）和（标准阴性孔平均OD值+3s）为可疑，可疑样品应重检一次，重检后的OD值大于标准阴性孔平均OD值3：判为阳性，小于标准阴性孔平均OD值一3判为阴性；重检仍为可疑者判为阳性，对于ELISA检测阳性动物，应结合剖检进行形态学鉴定或者PAS反应或者采样进行PCR才能确诊。
5.3聚合酶链式反应（PCR）检测5.3.1主要试剂与设备
5.3.1.1DNA抽提所需要的相关试剂见附录E。5.3.1.2引物：
针对羊源细粒棘球坳线粒体基因12srRNA：8）
Eg1f:5-CATTAATGTATTTTGTAAAGTTG-3EgIr:5'-CACATCATCTTACAATAACACC-3预期片段长度为255bp（参见附录F中F.1)。b）针对细粒棘球蜘基因组重复序列：Eg1121a:5'GAATGCAAGCAGCAGATG-3S
-TKAONiiKAca
SN/T 3903—2014
Eg1122a:5'-GAGATGAGTGAGAAGGAGTG-3赖期片段长度为 133 bp(参见 F.2)。c）根据细粒棘球呦的线粒体INAEgO/DNA-IMIF:5'-TCATATTIGTTTGAGKATYAGTKC-3EgO/DNA-IMIR:5'-(TAAATAAMACTATAAAAGAAAYMAC-3预期护增片段长度为285hp(参见F.3)引物合成后采用灭菌双蒸水均稀释为10μmal/1.。5.3.1.3电泳缓冲液：配制方法见13.3.1。5.3.1.4 PCR 仪
5.3.1.5电泳仪
5.3.1.6凝胶成像仪。
5.3.1.7
高速冷冻离心机.
5,3.1.8
高压灭菌锅。
5.3.1.9
80℃超低温冰箱，一25℃普通冰箱和4℃冰箱。5.3.2DNA的提取
按照附求E，或采用商品化DNA提取试剂盒提取待检组织DNA，实验室具体操你需要符合SN/T1193的和关要求。
5.3.3PCR反应体系
3个基因的PCR扩增反应同时进行，分别配制各自的反应体系，反应体系中除引物外，其余成分玛相同，具体配制如下：
在PCR管内，加人10×PCR缓冲液5.3.4.1针对羊源细粒棘球蝴线粒体基因12 s rRNA94 ℃预变性 5 min;之后 94 ℃变性 30 s,53 ℃退火 30 s.72℃延伸 45 s,共40个循环;最后72 ℃补充延伸 10 min。
5.3.4.2针对细粒棘球蝴基因组重复序列94 ℃预变性15 min;之后 95 ℃变性 1 nin,55 退火 1 min,72 ℃延件 1 min,共 40个循环;最后72℃延伸10min。
5,3.4.3针对细粒棘球蜘的线粒体1)NA95 C预变性 15 min:之后 94 变性 ］ min,50 ℃退火 I Imin-72 ℃延伸 1 Imil共40 个循坏;最后7℃延伸10min，
5.3.5琼脂精电泳
取5μl.FCR扩增产物.进行1将～2关的琼脂糖凝胶电泳，地冰结束后,用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。
iKAoNikAca
结果判定
5.3.6
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若检测样品有285bp或者133bp的条带，则判定为细粒棘球蜘絲虫PCR检测阳性，检测样品还有255bp的条带，可进一步判定为羊源细粒棘球嫩练虫PCR检测阳性，若检测样品无285hp和133bp的条带，则判定样品细粒棘球蜥虫PCR检测结果阴性。6
综合判定
6.1对进境动物应推荐采用EI.ISA方法进行初判，EL.ISA阳性动物应结合临床症状进行判定，并利用组织病理学或PCR方法进行确诊。6.2进行剖检时，在肝、肺等部位发现特定包囊即叫确诊，如形态间疑，则可采用PAS反应或PCR方法复核。
6.3对丁牛羊等的动物产品深用组织病理学方法或PCR方法进行确诊。5
-TKAoNKAca
SN/T 3903—2014
附录A
（资料性附录）
细粒棘球蝴模式图
细粒棘球模式图
图A.1
角皮层
原头坳
原头蝴
生发囊
生发囊
-TrKAoNiKAca
附录B
（规范性附录）
过碘酸希夫反应、ELISA及PCR相关溶液配制B.1过碘酸希夫反应相关试剂
B.1.1高碘酸溶液
将2g高碘酸溶于200mL蒸馏水中
B.1.2
1%淀粉糖化酶溶液
将1g淀粉糖化酶溶于100ml蒸馏水中Schiff试剂
B.1.3
碱性品红
NaHSO
活性炭
1.0g
2.0g
1.0g
1mol/LHCl
20mL
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烧杯内加入200mL蒸馏水，煮沸将碱性品红慢慢加人沸水中，边加入边搅拌，至完全溶解。待温度降至60℃~70℃时过滤至锥形瓶中，加入HCI摇勾，再加人NaHSO，塞紧瓶口，摇荡至完全溶解，用黑纸将瓶包严置于暗处过夜。次日加入活性炭，摇匀后迅速过滤于棕色瓶内，保存于4℃冰箱中。4亚硫酸氢盐溶液
B.1.4
10%偏重亚硫酸钠（NazS,O
1mol/LHCI
50m
50mL
在900mL蒸馏水中加人偏重亚硫酸钠溶液，再加人盐酸，混匀，B.1.5
Harris苏木素染液
苏木素
明矾［KAISO,)，·12H0
氧化汞
冰醋酸
无水乙醇
ELISA相关试剂
磷酸盐缓冲液（PBS,PH7.4）
B.2.1
Nacl
KH,PO
Na2HPO.·12H.O
KCI
1.0g
20.0g
0.5g
10mL
10mLwwW.bzxz.Net
8.0g
0.2g
5.37g
0.2g
SN/T 3903—2014
加蒸馏水至
1000 ml
B.2.2包被缓冲液（pH9.6,0.1mol/L碳酸盐缓冲液）NaacO
NaHCO
加蒸馏水至
3.18g
5.86g
1 000ml
B.2.3洗涤缓冲液（pH7.4.0.01mol/LPBST.含0.05%Tween-20）NA.HPO,·12H,O
NaH,PO, *2H,O
Nac!
吐温-20
加蒸馏水至
B.2.4封闭液
牛血清自蛋白(RSA)1 溶于 100 mL. PBS 中B.2.5稀释液
牛血清白蛋白(BSA)
加洗涤缓冲液至
2.91 g
0.308
8.50g
o.5 mt.
1 000 ml.
100 ml.
B,2.6底物缓冲液（0.05mol/L+pH5.0磷酸-柠酸）0.2 mtl/L Naz HPO, (28.4 g/L)0.1mo1/L柠檬酸(19.2g/1.)
加蒸馏水至
B,2.7TMB 使用液
25.7 ml.
24.3 ml.
100 mL
TMB(10mg/mL,浒解于二中基中酰胺DMF）150μl.底物缓冲液
H2O
B,2.8终止液(1 mol/L II,SO,)
10 ml.
6 μ
在578.3ml.蒸馏水中，逐滴加人浓硫酸（98%)217.7mL。B.3PCR 相关溶液
50倍TAE电泳浓缩缓冲液：取Tris碱242g、冰醋酸57.1ml.0.5mol/l.EDTA10mL.用5 mol/L的HCl调制 pII 8.0,定容至1 (00 mL，用前来用蒸馏水稀释 50倍即可。8
C.1抗原的制备
附录C
（规范性附录）
PAS反应中抗原和抗体的制备
SN/T 3903—2014
用灭菌注射器从寄生于羊或牛肝脏和肺脏的棘球蜘包囊抽取新鲜包囊液，离心除去原头蜘和其他棘球砂，取上清液，装人透析袋，用PEG20000浓缔 5借~10倍后通过 SephadexG-200柱，以0.02 mal/IpII 8 的 PBS(含 1 mal/L NaCl)洗脱.于 > 值 210 nm 处检测收集第一峰,即得纯化包虫抗原。C.2血清的制备
无菌采集患畜（或健康牛/羊)血铰盛于离心管或可以离心的器亚中（不加抗凝剂）,静置或置37℃环境中促其凝固,待血液凝固后,离心(一般为 3 000 t/min,离心5 min~~10 min),得到的上清液即为血清，可小心将上清液吸出（注意切勿吸出细胞成分）分装备用。C.3酶标二抗的制备
采集健康羊和牛血液，分离血清.用QAE.SephadexA-50离子交换剂分离IgG,添加福氏完全佐剂用两个玻璃注射器（中问用胶皮梵连接）来回推动乳化后免疫家兔，制备兔抗羊IgG和兔抗牛IgG的而清·仍以QAE Sephadex A-50分离IgG,制得第二抗体，即兔抗羊IgG 的IgG和兔抗牛IgG 的 IgG，用过碘酸盐法将辣根过氛化物酶与兔抗羊 IsG或兔抗牛lgG联结.制得嗨标第二抗体，加甘油至30%,4℃保存。
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附录D
（规范性附录）
FLISA检测中标准差的计算
假设有一组数值工！，?，\，，（皆为实数），其平均值为此组数值的标准差为：
V2G
一个较快求解的公式为：
...( D.1 )
-.(D.2)
(D.3)
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