【SN商检标准】 梨衰退植原体检疫鉴定方法

SN/T 4072—2014 梨衰退植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of pear decline Phytoplasma 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。 本标准主要起草人：王念武、陈劲松、黄伙水、沈建国、张永宏、翁瑞泉、牟海青、胡方平。 1 范围 本标准规定了梨衰退植原体的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境梨树的果苗、组织繁殖材料及媒介昆虫中可能携带梨衰退植原体的检疫鉴定。 2 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 polymerase chain reaction; PCR 聚合酶链式反应：PCR是在聚合酶的作用下，以DNA为模板，以dNTP为底物，以两条反向的引物对为起点，根据碱基配对原则，按照DNA的核苷酸顺序，合成与模板互补的DNA链的过程，是一种体外基因扩增技术。 2.2 DNA阳性对照 positive control 以含有梨衰退植原体的DNA提取液或是以携带有梨衰退植原体16SrRNA序列的阳性克隆质粒为模板。 2.3 DNA阴性对照 negative control 以健康的梨树叶脉或枝条韧皮部提取的总DNA为模板。 3 梨衰退植原体基本信息 梨衰退植原体 Peardecline phytoplasma 属于软壁菌门（Tenericutes）、软球菌纲（Mollicutes）、菌原体目（Mycoplasmatales）、菌原体科（Mycoplasmatales）、植原体属（Phytoplasma）、苹果畸形组 Apple proliferation group (16SrX)。其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据梨衰退植原体的16SrRNA基因碱基序列信息，采用植原体16S-23S rRNA通用引物和梨衰退植原体特异性引物相结合的巢式PCR方法，对该植原体进行鉴定。 5 仪器、用具和试剂 5.1 仪器 PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平（感量：0.001g）、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。 5.2 用具 研钵和研棒、可调移液器（2.5μl, 10μl, 20μl, 100μl, 200μl, 1000μl）、枪头（10μl, 200μl, 1000μl）。 5.3 试剂 DNA提取试剂见附录B，巢式PCR检测试剂见附录C。 6 检测鉴定方法 6.1 症状检查 仔细观察梨树的种苗、枝条、叶片等，症状描述参见附录A。 6.2 检疫样品的采集及制备 取有疑似症状的梨树叶、枝条等材料进行实验室检测鉴定；如发现有梨木虱，一并采集送实验室检测鉴定。 6.3 样品DNA提取 将采集的样品（包含梨树枝、叶、梨木虱）进行DNA提取，具体操作见附录B。 6.4 通用引物和特异性引物的巢式PCR扩增、凝胶电泳 梨衰退植原体16SrDNA的扩增使用巢式PCR方法，第一次PCR扩增使用的通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用的特异性引物为Apf1/rpds1。具体操作见附录C。 7 结果判定 在6.4检测中，通过通用P1/P7及特异性引物Apf1/rpds1两对引物进行巢式PCR扩增，若第一次和第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果均为阳性，则判定该样品携带梨衰退植原体；若第一次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阴性，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，则判定该样品携带梨衰退植原体；其他情况则判定该样品未携带梨衰退植原体。具体的阴性、阳性的判定见附录C。 8 样品保存与复核 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的梨衰退植原体样品应保存于-20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死植原体后方可做丢弃处理。 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 8.3 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。 附录A（资料性附录） A.1 分类地位 梨衰退植原体相关分类信息。