【SN商检标准】 梨衰退植原体检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4072—2014
梨衰退植原体检疫鉴定方法
Detection andidentification of peardeclinePhytoplasma2014-11-19发布
中华人民共和国
甜涂醒查真位
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4072—2014
本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：王念武、陈劲松、黄伙水、沈建国、张永宏、翁瑞泉、牟海青、胡方平。1范围
梨衰退植原体检疫鉴定方法
本标准规定了梨衰退植原体的检疫鉴定方法SN/T4072—2014
本标准适用于进出境梨树的果苗、组织繁殖材料及媒介昆虫中可能携带梨衰退植原体的检疫鉴定。2术语与定义
下列术语和定义适用于本文件
polymerasechainreaction;PCR
聚合酶链式反应
PCR是在聚合酶的作用下，以DNA为模板，以dNTP为底物，以两条反向的引物对为起点，根据碱基配对原则，按照DNA的核苷酸顺序，合成与模板互补的DNA链的过程，是一种体外基因扩增技术。2.2
DNA阳性对照
positive control
以含有梨衰退植原体的DNA提取液或是以携带有梨衰退植原体16SrRNA序列的阳性克隆质粒为模板。
DNA阴性对照negativecontrol
以健康的梨树叶脉或枝条韧皮部提取的总DNA为模板梨衰退植原体基本信息免费标准bzxz.net
梨衰退植原体Peardeclinephytoplasma属于软壁菌门（Tenericutes）、软球菌纲（Mollicutes）、菌原体目（Mycoplasmatales）、菌原体科（Mycoplasataceles）植原体属（Phytoplasma）、苹果畸形组Appleproliferation group(16SrX)。其他信息参见附录A。
4方法原理
根据梨衰退植原体的16SrRNA基因碱基序列信息，采用植原体16S-23SrRNA通用引物和梨衰退植原体特异性引物相结合的巢式PCR方法，对该植原体进行鉴定。5仪器、用具和试剂
5.1仪器
PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平（感量：0.001g）、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。1
SN/T4072—2014
5.2用具
研钵和研棒、可调移液器（2.5μ，10μ，20μ，100μ，200μ，1000μ）、枪头（10μ，200，1000）。5.3试剂
DNA提取试剂见附录B，巢式PCR检测试剂见附录C。6
检测鉴定方法
6.1症状检查
仔细观察梨树的种苗、枝条、叶片等，症状描述参见附录A，检疫样品的采集及制备
取有疑似症状的梨树叶、枝条等材料进行实验室检测鉴定；如发现有梨木虱，一并采集送实验室检测鉴定。
6.3样品DNA提取
将采集的样品（包含梨树枝、叶、梨木虱)进行DNA提取，具体操作见附录B。6.4通用引物和特异性引物的巢式PCR扩增、凝胶电泳梨衰退植原体16SrDNA的扩增使用巢式PCR方法，第一次PCR扩增使用的通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用的特异性引物为Apf1/rpds1。具体操作见附录C
7结果判定
在6.4检测中，通过通用P1/P7及特异性引物Apf1/rpds1两对引物进行巢式PCR扩增，若第一次和第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果均为阳性，则判定该样品携带梨衰退植原体；若第一次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阴性，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，则判定该样品携带梨衰退植原体；其他情况则判定该样品未携带梨衰退植原体。具体的阴性，阳性的判定见附录C。8样品保存与复核
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的梨衰退植原体样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死植原体后方可做丢弃处理。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。2
8.3复核
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由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。3
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A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
梨衰退植原体相关资料
梨衰退植原体Peardeclinephytoplasma属于软壁菌门（Tenericutes），软球菌纲（Mollicutes），菌原体目（Mycoplasmatales），菌原体科（Mycoplasataceles），植原体属（Phytoplasma），苹果畸形组Appleproliferationgroup(16Srx)。
A.2地理分布
非洲：利比亚。
大洋洲：澳大利亚。
欧洲：罗马尼亚，德国，意大利，瑞士，奥地利，捷克，斯洛伐克，法国，摩尔多瓦，荷兰，斯洛文尼亚，西班牙，南斯拉夫，希腊，英国，比利时（未证实)，俄罗斯（未证实）。北美洲：加拿大，美国。
亚洲：中国台湾。
A.3寄主范围
主要侵染梨属Pyrusspp.植物，以梨危害最为严重，梨树中，目前已知有Frenchpear（Pyruscommunis），Japanesepear（P.pyrifolia），Chinesepear（P.ussuriensis）等，均属于极易感染的品种。该病菌还可侵染Cydoniaoblonga，有时也侵染以槛为砧木嫁接而成的树木。A.4形态特征
病原体体外培养至今未能成功。类菌原体主要呈丝状，通常为具有3层膜的分枝体，但缺少硬的细胞壁。
生物学特性
病害可通过嫁接传播，但成功率较低，仅33%，实验条件下，用昆虫介体接种传染，在介体取食后两个月，植株便出现症状，接穗种类和树龄似乎不影响梨衰退病的发生。Schneider（1962）报道，在病株较细的次生叶脉的狭小筛管中存在大量类菌原体颗粒，但是在韧皮部的次生筛管中，类菌原体很少存在。现在认为，由类菌原体感染寄主产生的毒素代谢物由细的次生叶脉向次生筛管局部转移，在那里引起植株坏死。A.6
传播途径
自然传播主要是通过昆虫介体的迁移，但这通常仅在树木之间、果园之间与野生寄主之间作近距离4
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传播。大约在1832年，梨木虱Cacopsyllapyricola由欧洲传人美国，害虫不仅传播梨衰退病，而且在它取食时经唾液进人植物体内的毒素使植物遭受严重损失。这种昆虫介体在海拔较高的地区较为普遍。在瑞士，海拔600m～1000m的地方也存在这种介体，这种害虫不仅从梨树上迁移，而且以成虫在树皮裂缝中越冬。介体几小时就能获得类菌原体，但要成为持久性传毒者至少需3周时间。其他昆虫介体还未详细阐述过。但Lemoine(1984)认为C.pyri肯定是梨衰退病的传播介体。在国际贸易中，病菌随带菌的梨树植株、砧木、接穗或昆虫介体作远距离传播A.7危害症状
该病菌引起2种类型的症状：急性衰退（见图A.1)和慢性衰退（见图A.2）。急性衰退表现为植株快速凋萎，叶片转成暗红色、干燥，罹病植株在几天至数周内死亡。慢性衰退发生在以耐病或抗病植物（Pyruscommunis、P.betulifolia、P.calleryana或Cydoniaoblonga）为砧木的植株上，典型症状为叶片卷曲，秋季叶片过早变红并脱落。在随后的几年中，植株可能会变得树势衰弱、树叶减少、花少果疏甚至绝产。然而有些病株在呈现急性衰退前，会先表现慢性衰退、红叶及卷叶等病症。急性衰退极易出现在夏、秋两季，或病株面临干热的环境压力时，也助于此类病症之表现。除此之外，栽培梨树之根砧对于病症的类型也有影响，研究发现使用P.pyrifolia，P.ussuriensis及P.communis为砧木时，则罹病株更易表现出急性衰退型病症。
图A.1急性衰退症状
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注：以上图片引自EPPO官方网站：http：//eppo.org/QUARANTINE/bacteria/Pear_decline/PHYPPY_images.htm.
慢性衰退症状
附录B
（规范性附录）
DNA提取
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B.1取大约0.1g样品材料（叶柄、叶脉、韧皮部）或是媒介昆虫，加人液氮在无菌研钵中进行充分研磨。B.2
将粗汁液转移至1.5mL离心管，4℃下4000r/min离心8min。B.3将上清液转至新的1.5mL离心管中，4℃下12000r/min离心15min。B.4去掉上清液，加人1mLCTAB提取缓冲液，将离心管置于65℃水浴中温浴1h～1.5h，每隔20min左右将离心管颠倒混匀。
512000r/min，4℃离心2min。
将离心后的上清转移至一个新的离心管中，加人氯仿/异戊醇（24/1)1mL，混勾，形成乳浊液将乳浊液在12000r/min，4℃离心5min。将上清转人新管，加人800μL预冷的异丙醇，12000r/min，4℃离心10min。弃上清液，加人500μL的70%的乙醇，在12000r/min，4℃离心5min。B.10
弃掉上清液，干燥沉淀，加人100μL的灭菌蒸馏水溶解，置于一20℃冰箱内备用，长期应在一80℃的条件冻存。
注：其他的DNA提取方法也可以借鉴，可以选择使用稳定性好的商业DNA提取试剂盒，对于量少的样品，建议使用微量DNA提取试剂盒试进行DNA提取。7
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