【SN商检标准】 柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3748—2013
柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Sphaeropsis tumefaciens Hedges2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3748—2013
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：王卫芳、赵立荣、华丽、冯黎霞、王振华。1
1范围
柑橘枝瘤病菌检疫鉴定方法
本标准规定了植物检疫中柑橘枝瘤病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境柑橘及其他相关寄主中柑橘枝瘤病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T3748—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程检疫鉴定原理
根据柑橘枝瘤病菌在寄主上的为害症状、病菌培养性状与形态学特征作为鉴定柑橘枝瘤病菌的依据。柑橘枝瘤病菌的分类地位、分布、为害症状及寄主范围等背景资料参见附录A。仪器及用具
4.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、生物培养箱、PH计。4.2用具
样品袋、标签、放大镜、镊子、解刀、酒精灯、接种针、培养Ⅲ（直径9cm）、烧杯、三角瓶、试管、量筒、载玻片、盖玻片、打孔器（直径6mm）。5试剂和培养基
95%乙醇、无菌水、马铃薯葡葡萄糖琼脂培养基（PDA)（每1000mLPDA由200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成）、酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA)（每1000mLPDA中加人4.0mL25%乳酸）。
6检疫鉴定方法
6.1口岸现场查验
6.1.1抽样
口岸现场查验时，按照SN/T2455进行抽样与取样。1
SN/T3748—2013
6.1.2症状检查
重点查验枝条，观察枝条、茎干或及主干是否有肿胀突起或瘤状物，发生枝瘤的部位是否形成大量的芽并萌发丛生大量嫩枝，嫩枝长度是否超过1m，丛生的嫩枝是否形成肿瘤并最终死亡（检查要点参见A.3、图B.1）。
将可疑样品带回实验室做进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。
6.2实验室鉴定
6.2.1直接检验
观察记录枝瘤的外部及剖面症状特点，并置于体视显微镜下检查枝瘤组织外部及内部的质地，组织是否木质化，枝瘤内部之间是否有黑色条纹状菌丝体相连
6.2.2分离培养
采用组织分离培养法，用95%乙醇对枝瘤表皮下组织表面进行火焰消毒处理，将消毒过的组织切成5mmX5mm小块，放置于酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA，pH4）中，在30℃下分离培养。也可直接挑取枝瘤剖面中的黑色条纹状菌丝体于APDA中分离培养定期观察，将菌落边缘菌丝体置于新鲜的PDA平板上纯化，用于后续的病菌培养性状和形态学特征观察。6.2.3病菌培养性状观察
将纯化的菌株在PDA平板上培养8d，用火焰消毒打孔器（直径6mm），然后在菌落上打取菌丝体圆片，转接到新的PDA平板上，重复3次，于30℃培养，观察记录菌落的生长速度、颜色变化、分生孢子形成速度等培养性状。
6.2.4病菌形态学特征观察
选取发病枝条上的幼嫩枝瘤肿结切取有深褐色粒状分生孢子器的枝瘤组织块，再进行组织切片，置于生物显微镜下镜检；分离纯化得到病菌菌株在PDA平板上产生分生孢子器后进行显微镜检。观察记录分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子的形态大小及排列和着生方式。7鉴定特征
7.1病害症状
主要表现枝瘤和丛枝，症状的详细描述和图片参见A.3和图B.1。7.2病菌培养性状
在30℃温度下，分离物在PDA平板上生长茂盛，培养7d后直径达8.5cm，初期菌落淡黄色，后转为灰绿色。培养4d后即开始产孢，培养7d后分生孢子器布满整个菌落表面并溢出分生孢子团。分生孢子器深褐色，呈颗粒状，成熟后溢出的分生孢子在分生孢子器顶部聚集成团，乳白色、呈黏稠的液滴状。
3病菌形态学特征
分生孢子器产生在皮层上，半埋生，球形至亚球形、深褐色，具孔口，单生或聚生，直径180um～2
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220uμm。分生孢子器壁由多层长形细胞排列组成，外层细胞壁比内层细胞壁厚。分生孢子梗无色透明，倒梨形至圆柱形，（5μm～10μm）×（3μm5μm），排列在分生孢子器内壁细胞层上。病菌产生大小两种类型的分生孢子，大型分生孢子无色透明至淡黄色，椭圆形至倒卵形，顶部圆基部平，（20μm～34μm）×（6μm~10μm）（酸橙上），31μm×4.6μm（夹竹桃上），无隔，偶1隔，但在人工培养条件下0～2隔。小型分生孢子透明，椭圆形至卵圆形，两端圆，每端有液泡2个，大小为（5μm～10um）×（3μm～5μm）（酸橙上），4μm×1.5μm（鳄梨上）（病菌形态图参见图B.2）。8结果判定
病害的症状与病菌的培养性状及形态学特征！橘枝瘤病菌（SphaeropsistumefaciensHedges）。9样品和资料的保存
菌种和DNA样品的保存
菌株在含30%甘油的冻存管中于
7.2和7.3特征描述相吻合，即可判定为检出相80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期转管，标注分离物来源、寄主、分离时间和鉴定人。9.2检验资料的保存
料，以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日妥善保存检验报告，包括症状、病菌等图S
期、方法、结果等，并有检验人签名。3
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A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
柑橘枝瘤病菌的分类地位、地理分布和为害症状英文名：Sphaeropsisknot,Sphaeropsistumor,Sphaeropsisgall,Sphaeropsistipblight学名：SphaeropsistumefaciensHedges（1911）在分类上隶属于无性型真菌，腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）、球壳孢属（Sphaeropsis）。有性态：在自然条件下未发现有性态。A.2地理分布
亚洲：以色列、印度、斯里兰卡。欧洲：英国、法国、德国、意大利、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙。大洋洲：澳大利亚。
美洲：美国（加利福尼亚、佛罗里达州、夏威夷）、牙买加、古巴、印度尼西亚、秘鲁、委内瑞拉。非洲：喀麦隆、埃及、圭亚那。A.3病害症状
A.3.1在柑橘上症状（包括酸橙、甜橙、粗皮柠檬和柑和橘的杂交种）表现枝瘤（thegallorknoteffect)和丛枝（witchesbroomeffect)两类症状，但以枝瘤及枝瘤溃疡为主（参见图B.1图片1，3～4）。a）枝瘤：感病部位肿胀，形成肿结（knot）、瘤状物（gall-like)和肿瘤（tumor）。枝瘤圆球形，直径1cm～7cm，但在茎干上有时变长，直径1cm～7cm。肿瘤幼嫩时表面软但很快变硬，开始被正常的树皮莜盖，后来树皮变成白色、粗糙、类似软木塞一样的组织。病变树皮面积逐渐伸展扩大成枝瘤，表面出现裂缝而膨胀开裂、溃疡，而内部组织坚硬、木质化。分生孢子器在田间不常见，但枝瘤形成的早期（即在枝条上形成肿结），分生孢子器大量产生在肿结的表面，然而枝瘤形成后期，因枝瘤颜色加深耳组织溃疡、开裂，坚硬、木质化，分生孢子器不容易被发现，但枝条上可发生多个枝瘤，枝瘤内部之间有黑色条纹状菌丝体相连。枝瘤紧紧地贴在茎干上，当多个枝瘤环绕茎干常导致茎干死亡。b）丛枝：一个枝瘤可形成大量的芽，并萌发出多达40根嫩枝，有些嫩枝可长达1m以上，并且这种新生的嫩枝上也常常带有结或瘤，这些新生的不正常嫩枝将枯萎并最终死亡。肿瘤也能发生在主干上，严重时导致整个植株死亡。A.3.2在鳄梨上的症状
鳄梨肿瘤半圆形至不规则形，小至直径达8cm。初期，肿瘤表面浅褐色，老熟后表面开裂，颜色变深，并出现许多细小的黑色分生孢子器。肿瘤在树冠上不规则分布，最终引起枝条死亡。嫩枝肿瘤的纵4
SN/T3748—2013
切面呈现形态不正常的皮层和木质部组织，组织变黄，部分坏死。幼嫩肿瘤表面软但很快变硬。A.3.3病害在冬青上的症状
冬青症状与柑橘基本相似，但以枝条肿胀、轻微溃疡、嫩枝增生为主（参见图B.1图片2,56）。A.4侵染传播
A.4.1侵染途径
在人工接种条件下柑橘枝瘤病菌需要机械伤口进行侵染；在田间，嫁接、修剪造成的机械损伤及鸟、昆虫、冰和风害等自然因素造成的伤口均可引起病菌的侵染。A.4.2传播方式
柑橘枝瘤病菌可借风、雨进行近距离传播，通过嫁接病株砍伐、修剪工具、雨水溅泼在苗圃、田间和果园之间传播；病菌可在贮运中存活，带病的植物组织如树枝、病叶以及接穗等繁殖材料调运是病菌远距离传播的主要途径。在下雨条件下，发病及死亡枝条上的分生孢子器释放分生孢子进行病害传播。潮湿的天气有利于分生孢子的萌发与侵染。A,5致病性测定
柑橘枝瘤病菌经伤口或切口能侵染柑橘，接种4h后分生孢子萌发，穿刺树皮，引起侵染细胞肿大、增殖。接种2周～3周后，酸橙嫩枝上发现分生孢子器的产生。接种25d后，枝瘤进一步增大，接种75d后侵染组织坏死。
A.6柑橘枝瘤病菌的寄主范围（参见表A.1)）表A.1
柑橘枝瘤病菌的寄主种类
柑橘属Citrusspp.，主要包括酸橙Citrushystria，菜蒙Citrusaurantifolia、橙Cit-芸香科Rutaceae
冬青科Aquifoliaceae
桑科Moraceae
漆树科Anacardiaceae
杨梅科Myricaceae
夹竹桃科Apocynaceae
桃金娘科Myrtaceae
藤黄科Clusiaceae
rus sinensis、粗皮柠檬Citrus jambhiri、葡葡柚grapefruit/CitrusParadisi、橘Citrusreticulata等，积属Poncirusspp.，甜橙与桔的杂交种ortanique，柑橘与金桔的杂交种（CitrusreticulataXFortunella margarita）冬青属Ilerspp.
桑属Morusspp.
芒果属Mangiferaspp.，肖乳香属Schinus spp.，巴西胡椒木Schinusterebinthifo-liuswwW.bzxz.Net
杨梅属Myricaspp.
假虎刺属Carissaspp.，夹竹桃属Neriumspp.红干层属Callistemonspp.，油加利属Eucalyptusspp.，蒲桃属Eugenia spp元宝草属Hypericumspp
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海桐花科Pittosporaceae
柏科Cupressaceae
大载科Euphorbiaceae
豆科Fabaceae
樟科Lauraceae
蔷薇科Rosaceae
茜草科Rubiaceae
木犀科Oleacea
樟科Lauraceae
表A.1（续）
海桐花属Pittosporumspp.
柏木属Cupressusspp.
麻疯树属Jatrophaspp.
羊蹄甲属Bauhiniaspp.，紫藤属Wisteriaspp.樟属Cinnamomumspp.
李属Prunn
龙船花属Lora spp.，绢冠茜属Portlandia spp女贞属Ligustrum spp.
鳄梨PerseaamericanaMill
说明：
主干肿瘤；
支干肿瘤；
肿瘤上枝条丛生；
新生嫩枝节膨大；
女巫扫把状丛枝；
丛枝枯死。
附录B
（资料性附录）
柑橘枝瘤病的症状与病原菌形态特征图SN/T3748—2013
注：1，3，5：寄主为柑橘Citrusspp.，2，4，6寄主为（冬青Ilerspp.），图片1~3引自http：//ipmimages.org/FloridaDivisionofPlantIndustryArchive图片4~6引自JamesO.Strandberg。图B.1柑橘枝瘤病菌为害所致的症状图
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