【行业标准】 食品中志贺氏菌分群检测MPCR-DHPLC法

中华人民共和国出人境检验检校行业标准SN/1 2565---2010
食品中装有氏南分群检测
MICH-PLC法
Grompoimg dctoxton et Shigetia in fonl-.MPCE-DTIPAC
2010·05-27 发布
数码除力
金品伴网ht
2010-12-01实施
本标雅按照CB,T1.：
2005给出晓规则南草
木际祖山区家认证认可滥督等理委员会操为口SN/T 2565.2010
本标准起卓单位进宁出人境检验检监尺山余围人控检验检收尚、西藏用入境检验检疫局，不标准士费起卓人，郑秋月、典弥始、需质点、1艳、徐杨、前、于灵、工长文、赵听、徐君怡、亦列撒：
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一滋園
食品中志医分群检测
MFRFTHHH法
SK/T 2565---20[0
本示耀规定了食品中志贺民菌，包新福氏常贺点菌，末齿志供低的，鲍低志贺民菌、制疾志贸民菌的MPCR-PLC分样检测方送
本弥症适用食品中志贺医菌，包活相忘贺民荫、宋氏志强民菌、鲍低志贺民菌、疾志贺民菌的MPCRTHPT.C快速分样检测
2规跪性引用文件
下到文对一本文件的成川左必刊守的。风注斯的引用义件仅期的版本活用一本文件，凡是小注谢的引用文件,其最新啵本(包括肌有的修政单)逅周了本文件。G3/T4789.：食品卫牛做生物检验志贺氏菌检验让/T6582分新实验用水期格和减验分法CR1948？实验室生物安全谢要求G3/27.103实验室质量控制规范食片分尘荡学检验3缩璐谱
下列缔略讲适用下本文件。
PCyulymerage hsin re2clion
聚合虏链武反应：
服amitiplex h
念重 PCR.
DHPCienatning Rnigh periormance lin ste ekermastogruphy变性高效液相色谱。
黑乙其饿乙酸盘
44物安金措施
为「保护实验室人员的安伞，应士厂各资悟的工下作人员检测致病菌，所有培养物质小心处置，应按照（319.8的台关规是执行
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toomnt
SN/T2565--2010
5废穿物处理和防止污染的措施
5.1格测过理中的废充物经121%：高成河就31率少30：5电齐置。5.2检测过理十防止资支污染的者施数（812193期效熟行原理
MCR，义称多量物PCR战复心K，未个一CR应体系甲加上对以上引物，同时增出多个核儿设的PCK反应，其没立风，及京实剂和操作过程·股PCR相同。DHIPLC分析技术是府用了对发村液机色谱质望A儿法行分寄：离了采三之基胺之酸盐缓冲液（TEAA）核凸腰片段分子中负电花的减接楼基计专TFAA分子中册正电荷的氮基发生静电作用柜暖列，同时AA分了中的三之光相装商内烷属发牛疏水作力而格点吸习随过流动相中的乙腊的梯发洗说达到将不制人小的核Ⅱ酸片段分离。7试剂和材料
除男有规定外，所有试放纯度应为忙语纪，求为火都纯水，符衍合GB/TS682中一级水的规格，所有试剂均门无DNA随污染的容帮分装。7.1Ta NA
2.2dNTP:dATP,dTTP,CCP,GTT
7310×PcR滋203amo1/LTri:-H.184），200mmol/L氮化，15mmol/L氯化馈。引物：引物序见附录A装A.
7.5TE溶液、
7.6 103 SDS.
7.7酶K(20 rig/ml)
7.氯伦钠溶液(NaC). ro0.T.:
7.H 10X GTAB.
7、13
三氨下烧：
异茂醇。
昇丙爵。
7.1470%乙醇。此内容来自标准下载网
D!IPL缓冲滋冲液A为n.TFAA和23m.7腊混合加水定溶案1ocomL缀冲7. 15
溶液为50mTEAA和230艺晴混台，加窖至1m级冲游液75%艺晴主要仪器和设备
.1 FCR 仪。
8.2 DHPIL:议。
8.3高速离心机：离心转速18030g8.4CR阅率1件台，
8.5微量可移液器和失菌吸头2..tu.3l..200c00m..2
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B.6灭菌PCR反应管
9家法提要与检测程序
3.1有法提要
5/ 2565--2010
志贺民菌展根据生化反应及抗原组成内分为A、、、）四个血消群（种）：A弹为澜疾志贺氏的，B群福志贸氏菌，端为创低志菌为案以点微民菌，本方法采门MPC同利增惠资民尚及！四个而活升。MPR产物码利以宠性案件下的A分离技本术猴A护增片段长就的不，按从小到大顺厚表次乐核并酸产段，从而实现对食品中湖设低菌进行快速分群扮测
92被测程序
MP限DIPiC分群拉测品中志贺低脂检测流释光图1鞋昂御密
瑞肉汤
分群鉴众
硼性裂
纳限造
可阳能结架
传统方法稠认
图1-油群检测食品中志贸氏菌流程圈htt
N/T2565-2015
10操作步骤
10.1样品制备、增茵培养和分离按照B/下！跳行最和车离养
11. 2增菌滋模板 DW的制备
收1的蒂藏！5nl加高心答，o离心1mi;吸茶「清液，最淀加567TE游液（H8c）然准.（3蛋产腾K2mg/m，混约37溶1 h;川 1 T,氮化钠( mo/L).混-加 SC uL TAB/氯化钠溶液(1 CTAB和0.？ ol/氯化钠）混列65（箱浴10 1nit;加等体积三氟烷/异皮醇（体积为24：1）混：1300Cg离心[0 m;双上清液等体积聯/二氛[烧：并股剪：体积比为2524：1).混，13 000g离心19 min;及清澈，加0.6倍依积弄内醇轻轻混匀，：c3离心16mn：收沉滤，70么醇消洗2，下澡，加ICTF溶波(H0)溶轻,此鼠VA爱。不能立即检测：保存下：备用：按同样法能多阻非对照萨株和渐性对照肉株的增主液题板，也可役无商业化哟NA提取战剂盒并接其说别制备模戒INA
10.3LNA浓度和纯度射测定
攻5l.！NA辫波加水度磷释牟：=nl..使用核龄蛋当分析俊或紧外分光光度计测260mim和280nn处的光密度使，LNA的浓度象照点让弹：9- K 5071 000
NA浓受,单待为微克每微于（）；A
260nm处的吸光杭：
核梭稀择倍数.
1OI. 50 pg/ml. 双 DNA...
(OD比偿在1,1. 谢,迁宦R增。
10.4 PCR扩增
14.1PtR 反匠体系(25 ):10x PCk缕浓 t. cIP(C mml/L)2 L、IaG NA 聚介酶(/)2模板八An82代剩神黑贺民菌来民惠双民肉鲍限贺菌、该志贺氏菌的「下游引物（1o各（衣率2F10.4.2反应系件：9预变性3mir:91.整净64（送大60),72%延件608，逆行35个缩环72 延7 mn,4 保存发应产物。
1。4,3将 PCR物进行:分
注：限反成参媒去区技增假监号们过行调10.5PL测
10.5.1#PI息分析条件
也需对:PS DV3 &: CDA3ap (性(1. 6 mrix5: nir.糖 3 ur)10.5.1.1
10.5. 1.2 科:50
10.51.3流动你积
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0.mn、55.%缎冲率液A..0綫冲溶液0.5mm.59.2%缓冲深液A，19.83爆件液上4.3n.40.6%缓冲溶液A.缓降治3:—8.Cmn.37.3%缓冲溶液A.62.7x级密液13，11.81rim,35,5乐綫冲溶渡A,6.6线冲溶液15.5min,3t3缓冲辫A6.7率凝计穿液3，1.5.1, 4流速:0. 9 /mm
SN/1 2565 --2010
10.5.1.5检测踏：炭光检测器（米源：5数00激发磨带宽：13m发乐谱带宽：mm检测美嫩疫：在波长Hmm积分2。
10.516上样元PR10u.
10. 5. 2FHPLC分析
们.5.装术PR产物前原度致改置在C会属报的微礼中10. 5. 2. 2登求DHP1分新系统投比 13：设出1HP1分析条件建立检测序并运行。注：分条产限码mc议路市号的回产适当的词整10.6质控对照设置
检测过程中度分则设和型对盟利的性对照，阳性对照为福民志贺民谢、宋试心贺低菌，抛医志贺民菌、痢疾志贺民菊标雅菌探。阴性对照为大肠埃景民案等非标致病菌的弥箱菌族11结果及判断
11.1质控标准
11.1.1段性对照：无吸改峰出现11.1.2阳性对照：出典罩的PR产物吸收峰，且降吸收值大下1V。11.1.3不符会1述对照质控标准的视为最效，11.2结果判定与报告
11. 2. 1 检测结果判定
11.2.1.1福氏志贺氏离经MPCR可增出 62 bp利353 p两个片段的产物,DHPL检测该两个 PCR产物阻性暇收峰
11.1,案氏志贺氏菌经MR可扩增出和两个片段的产物，HP检测山该两个PCR产物组性聚收
11.21,鲍低贺低因经M心求可扩增出h和然7两个片段的“物。1C检测出该两个CR产物阳吸收峰，
11.2.1.4输疾恶贺底肉经M[C叫增出62bp和73 的两个片段的物1)HP1检灿出该两^R产物阴性瑕敢峰，
注：第民志质民离引物与部分人疾率来行交度质，3HPLC检测大肠埃希民南S85,55sX9,E243774，[5:0105,O12：等会2 的PR单-物收降。11.2.2结果报告
11.2.2.1检测栏品无典单PCR产物阳性吸收洛中现，下均定样品结为阴生立接报告未检出××K驾民荫
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11.2.2.？检测样品说其型书TR产努阳性爱妆率：冲泽时间与阻性对照一效。1吸收峰值六3mV时，可判定该样品结果为文××志贺需疑用性.11.2.2.3检测栏m出现典到的CR产物相性暖空峰4吸改峰值小于3mV时，建议样本亚做，量做结果峰吸收位仍小于mV则为×志识即否贴为文义×志贺氏菌可疑。11.2.2.4对了可数义×感贺民菌图性：成签（13/14789.5做进步的生化鉴能和报告。6
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病感名称
点微氏茵
谛民惠贺民菌
天民贺民菌
说民点货氏園
谢疾意贺民函
（益性附蒙）
叫懒除烈
食品中志贺低菌M网分群检测所用引物序列A，1
卡因名称
叫物序刻
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SN/T 2565--2010
预期片段/hp
SN/T 2565-2010
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中华人龄共以出人境格验督庭
行业标雅
食品中患贺民菌分群检测
MICR-DHPLC法
SN/1 23S-- 2G13
中国标洋山版祖出藏
发兴门外一里北街1（号
邢政编码：130.3
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电话:687239468857518
中标流出版补案泉印刷！刷
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20十13川第版2010个40月第，次印制2数11 690
书：155036：2-2.18-

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