【行业标准】 水产品中致病性弧菌检测MPCR-DHPLC法

华人民北和国出人检验检府行标准NN/T2564- 2010
水产品中致病性弧菌检测
MPCR-IPLC 法
Detesllon of pathenegnma Vihpis in stafred-MHELE
2010-05-27发布
数污线
国质运督骏检装总局
全品伴网ht
2010-12-01 实施
本标准按照G号/T1.12009给出的规则起量。本准岛团家认证认可鼠替警理委办会提出并归口。SN/T2$64---2010
本标准息草单查：中作人社共和司：出大医检验粉渡尚，中华人民共和医福建出人境检验检校周、中华人民其初园西藏山入境验验检疫点本标准主婴起草人郑秋月、尊际娟徐洛性、下思郑品川封、装轶忍、金冷、退、工顺意、王瓶http：//foodmate.net菠萄
水产山滋性潮菌检测
MEh THRTC
NW/T 2564--2010
东标规亲水产中游准性点国，张菌创价阅、落荣弧菌拟态驱图！和激病性菊的MPCR DHPIC检测方汰
本外适丁水产叫副溶血件弧膚查乱限菌创伤崖、游深潮菌、教态弧案种致病性狐菌的快速检测.
2规范性引用文件
下列义件对本支的必不可少的，注三期的以用文件，仅注日斯的版本活于文，小楚不注期的文件，法最新版会（限指所有的信设单适用木文件。(H/78？食品1生微牛物检途副游血性燃菌检验CF/T6682分析实强空用水规格和试鉴方法用19183实验室土动安个通要
G3274C3实验空质控制规范食品分生物学检验S02211食品中需源弧内梭旋升头M代.No.156食致痴性弧闲的检测计数3翁陷爵
下列缩略语适市下本义件
patolymerwe ghsint reactien
聚合武反所。
MRmultiplex PrH
率= PCR.
deraluringhtgh perfarmsnceSiquidcrmadograptyHDHPEC
变洋高效没剂色谱。
1.7.基铵L峻表
生物安会措施
为「保实验室人员的安全应问具智资必的工作人员检测效法菌，所有培养物成小心处告。应http:
foodmate.net
SR/1 2564-2010bZxz.net
照G「189的有美然执行
5成奔物处理和防止污染的描照
5.1检测划择的废物需经13国天需处品至少32适用齐置。,2检测过程小防止交义河染的据照核规究执行原
多PCR.义率立引物PR或点合PR.宝界个5一PCR应体系果1两对以引物同时扩增出多个核酸用段的卫R度底，上成成理，质量试式剂不接作过得与-般PR同，P分析技茶应时离广对反门液门色塔原耀大是计分，商对思用三之禁腰之热缓冲落液（1EAA）核许酸升段分中值直业前微酸限本商与T正A分子中销正电荷的氮基发生静出作用剂吸引，同时TEAA分产牛的个之4同家销C：亲适的就求发生疏水作用而相立吸学，通过流动霜中的情的佛度淡阅这到将不国大小的秘货骏中分肉7试剂利材料
除另有规定外，所战剂纯应本色落纯：水为火商超纪永，符合GB/T982中级水的规格。所有试刻均川无A河案的容给分装7,1TDNA系
7.2ANTP.dAT,dTTPdCTP.GGTP
7.3n×PcR缘净液：20umm2/ris-r！8.）.2mol/L氯化仰，5mnol/l氯化钱。7.4
引物：物享划附录A表A.
TE溶液：
蛋酶K(20 mg/ml.)
氯化钠溶液tNac)5ml/cmo
三氮熔
异丙脖。
7.14 7042薛
.151LC缓冲液，凝落液A和脂泥合水定容至1000缓冲溶液B为5CmI.TEAA利25Cn.Z流台，实定容1C0ml级冲湾液为7SZ情8主要仪器和设备
B.1PCR 仪,
8.2DHPIC仪
8.3高速离心：离心转18（0只，8.4PR超净工行台：
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8.微可调移液器菌吸00o.
s.s阅C度应管。
方法耀题与检测程序
0.1方法要
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本方法片水产品中5球数将性张量增菊成念合增菌技术应用式量R向时扩增水品中刷落血性诚菌、提乱弧菌、创伤弧萨落蒙弱菌和拟东孤新，新效病性频菌。童PCR产物再利DHPLC非变条件下的DNA分离技术，根贴DA专善片段长度的不闻，按照从小溯大领序旅次洗脱核背酸激，从而实版对水产品中与和数病性胍用行惊密检测。9.2检测程序
MPCR-nP法检汉密产品海州菌玲测流祝图品
增萨肉滋滋萄台噬菌肉
细瑞南
阴卧缩乐
得根告
可凝性结果
传统方法确识
图限滋检测水产品中数病性派商流程图http
S3/ 2564 2010
10操作骤
样品制备和增菌培教
10.1.1水产品中敏病性弧菌增菌磨察101.11制血南测样的市、新台密参照77方理行10.11.2、不瓦机萄检测品的中虚高示驿签点6N/下2623方法进行。0.11创伤频南游孤商和股态点格测的制活需增养和分离步深密照人MKI内3G方证行。
101.2水产滑中致病性弧菌复合增菌培养以窗化文水产品限样品，粉率活分别灿人装个m双料3氛化钠蛋白滕水为荣三角瓶或折出式均质袋市，控是3mn~：n：.或诺1率负瓶或购质我时厂片在36（请养1b~6产品在冷最设冷冻亲件下保行！之内的需要培养保心附鼠以上的路要培准从增菌荡中股告0人到装有1）m.双料2化钠自陈水的式管它，游与店在36（培养.8 h.2 ..
.？增菌液榄板13NA.的制备
最10，1中的格效病性点菌的培关及合菌培养的表0.1.2培养的欧增菌效！5.灿到1.5m满离心伴13「股充清液股流滋.加567液（80）浮，30和20ng混句37温浴1100款化钠（5l/L）装勾.加8LrAB氯化纳率液（1路CTAB租0me/.化钠）深甸.6S混浴10mia：等味积二微忧/导设醇（全积房表2：，，，游句，3c02g良心10mn；取上游激，加等体视险/一氯中统/户我醇（体积比为25：2.报匀.1？3离心1rim：取上消液加0.6倍休积内雅，轻轻湿句13000商心1Cmm取宝法用7多7.送2次，T送刘：00.TE溶液（pH8.C）器游此原为A落液：举不能即移保存」一：帝用，按片样为运制阳性对照菌株和谢性对照瑞株的曾南液模发NA。也可便用尚业化的！探取试剂盒并按其说明制备模板1NA10.33NA浓度和纯衰的测宠
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A-20r比处购吸光准：
A核稀释数。
注：S0LNA：m.：9之门证兰TPR增10.4PCE扩增
10 4.1PCR这成体系(20 1.),10xTCR液8eN-P( mIxoi/)2T,1a4 1)NA聚合障)C.，模板NA6性率数驱摄态想尚、崔乱狐菌、创伤强购卒物10 um/分期为 0.5 1水补足20u104.2度条件颜要性，60源火2延佛60证行35个微环httn
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或：这量和数可楼提专退考保的不同效兴叫器10.5TFL检测
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3N/6 2584-- 2010
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10.5.1.24温
0.51.3流动相（体积比）
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：3.6mn412%级液A.56.25游液11：6.3m38.2鼎搬滋液A1.8添种路3：-0.9m证.38.3袋冲泽激A.53.7端签种率液13.0in3.0磁溶确.0.效冲睿液3。10.5.1.4流:c.ot./nit
10.5，1.5检测器：炭为检测件（元源：15WXem4微发增带宽：151:n；发对牌书宽.15.3nm检认是数虑：在波长sto min积分2s。0.1.PRC
10.5.2H用14分析
10.5.1整装有PC产物的反誉放胃4“H金高板的微孔，1052.2登价析系统，按照1C5，1设置F1C分析条件烈立检划程序并滋行。注：分研系件可限据这据用学法行适的调整1C.6质控刘照设置
整测对型中点分测没恒性对照医性对照。和性对照为敏病注弧菌的标非菊殊，阳性对照为大场换帮氏肉等下H标激病性甄因的杯雅株11结果摄判断
11.1顾控标准
1.1.1阴性对照，无吸收详期
11.1.2据临刘照：冲凯其的P浪产赠收峰：1年吸收筑人311V11.1.3不符合上送对拍点控标消的视为万效11、2结果判突和报贷
检测品典产物性，判品结只闻性接报牛未检刷溶11.2.1
性点肉、蜜出弧菌、创价弧商溶案、拟条2.2检测样品出现典卫约尺产物性吸收峰，出时间三各致病格诞菌领期扩增片段大小的图特对职析·致，H设收降估人下3V，可其发样品缩味为×X致病性驱菌可繁性11..3检测栏以其单的我产配性咳收降圾收年小」3mV时，建议样本市。步搬http
SN/T2564-2010
结果吸收值仍小于V测意病性菌阅心则为人致病性弧菌可凝阳性11.2.4对下×X×效病性弧菌可选陪性黑，空热GH/T478,7.SN/T1032.NMKI.N.156微过一步的生化鉴定和报行，
http：//foodmate.net序
附录A
数茶性深）
水产品中致病性驱菌筛限检测所用引物序例8S/2564—2010
表A.1水产品中致性弧简退DFLC检测所用引物序列燕名称
溶而性菌
创的医
菜鸡卤
拟态狐菌
引物序刻
S'-rre nst ihy igu aca Bg xan as?+'-ges afr ltu tyt ce ae cgr c 3*He-cng gt: igy tar ung heh ag n 3?ge-igr gan Rar use cic ate aga g.3eerg a lay s teg gen rag r 3*5'-ia cya aat tc gac zga 1ez. n.s*S' eag gr iey ig: org wi aay a ?*Sogat cua ayl ne yat: aci mgh h 3-98 rt tg E ef rcg, Bug a 3*S'-ye? tgr. ege agr gi leg. ige a ?http
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中监人岗共和国出人原检验检疫行业郝滩
水产品中致病性弧菌检测
MCR-DHMA 法
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加致销码：：0004%
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电话：6852904568517518
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宁数13子学
201c年0月第版2010年10月第一次印别 数 1-- G0
书5：135066221180
实价16.0025
UE0C-79G2
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