【行业标准】 食品中霍乱弧菌分群检测MPCR-DHPLC法

中化人民共和国业境检验检行业标准S3/T 2562--2010
食品中利菌分群检测
MPCRILC法
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2010-05-27 发布
家质量股管痘服局
金品伴网ht
2010-12-01实施
本标准按照（3/T1、1一2C09给的速划愿市5F/T 2562---2010
本标旗出国家认证认可益督管艺员会景出开计门。本标滩越产单，中华人居共和国汇出大蝶检验检察局、中华人民共国裕禁出人境检验检按与、中华人民其和国西藏出人境检验检密局，本标雅主婆越单人郑秋月、牌际、都将实这所郑的，货脱馨刘内，徐君怡、主秋摘李建民秋丽府颜：
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食品中建乳限随分群检测
SN/1 2562--2010
本保准规定广食品中需乱弧需，色括（1群，0139群和非01/0135举需部狐菌的MPCRDP分群检测方法。
本标准用十食品中蕉乱弧商，包括01弹，0139群甘01/非（139群霍弧菌的MPCR11F快速分详检测
2规范性引用要件
下刻文件对于本文件的成川是必不所少的，凡是注用期的川用文件。仪江日期的版不适用于求文件，州不注斯的以用义件其般新版木（包拓所有的修改单)适用于不文件。/工6682分析实骏审出水规路程武滋方然GB19189实验室生物姿通用紧求
63/127代3实验家质量制规营食正分牛物举检验门1022山口食品中社所熙菌检验京法3缩略语
下列缔略港用于本义件。
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繁食擀链式反应，
Mmex Pu
多能PCR.
Turcdenairingpighperforagncanidaramatoghaphy变性高效液相色谱
三之铵俊。
4先物安全措施
为保护实验室人员的安全·应由只备资格的工作天员检测致病所有赔养物应小心处管。应核照8的规热行
http:
SW/T2562--2010
5废弃物处理和防止污梁的措施
51检测过积户的废牵需12：高主次菊外学3）n片再许暨5.2检测热程中防改污案的措资（.27103规案执行6原輝
MPR又称多重物PR城忘合尺R，是同R度体条甲加两对以引物，向时增出多个核胶片段的R应，北反应原是，显立式剂和作过程与般PR相同。DIIPC分析技术足应用离于对反列液相谢原班对1V牛以违分离。离了对采用乙基胺乙较盘缓冲游液（TEAA）核甘酸片段分子中专负自代的磷较根法团与TEAA分下中带正电的氢基发生前也作用相互吸司时下FA中的三个与山东相（表百效惠发生疏水月力而吸，通过流动相中的之脂的梯度洗脱达到路不瓦太小的核节彩油要分离。7试剂和材料
陈为有规定外，门有诚剂纯皮度为谱年：水灵离超纯水，符3/T6682中一级水的规格所有试剂的用心DNA所活染穿器分装7.1DNA聚介酶，
7.2dNTP.AFP.dTP.&CTPdG\P
7.310xPR线冲液：200mmc/1r1p184），2c0mol/款化邻(KCi).15mmol/.氮化镁(MgCl)
7.引物：物烈见附录AA二
7.5TE溶液
7. 6153 513
白酶K(2omg/rl.)。
氯化钠溶液Nac)5mol/i斗c.7l/
7.910% CTA3.
“氯甲烧。
7.11 异成醇。
7.13异酉蒋。
7、 1470%之聘。
人151HP缓冲液：缓冲溶液A为ECm1.TTAA和2:0uL.7.精混合，川水是容率1C00ml缓冲率滋B为50ml.TEAA和25)ml.2温含M实定密年000mL缓冲溶液1为75%乙膜，8主影仪器和设备
8.1PCR仪。
8.2DHPIC仪。
8.3高速离心机：离心转速18053g8.4PCR照净T台
http:
8.5该爱可许移液器利灭菌吸头210g0！.20元1000G求菌PCR反成件
9方法提要与检测程序
9.1法提要
5网 2562--2010
本方法采旧MR同时折单滑惠案及比个清祥（O1群O139群非（.非139祥）MR产物再利用DHPLC变性终件的分离技术，根珺增片段长度的不司校从小到人顺序依次济脱核节够片段，只们实现对食品中出管乱弧齿进行快速分群检测。9.2检测程序
MPCRLHPIC分祥检测食品中在生邮脑的冷测流程见图1。萃品制务
细新A比城
MP:RYa
D低器分
可装阳性结器
非逸然布让
结果报
图1M肤分格测品中馨乱菌流程图10操作形骤
10、1样品制备,增菌培葬和分离食品中需乱弧菌分样检测样用的调各增养评分离少螺参照外/TC22力法进行。http:
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10.2增菌漆模板DNA的制备
敢101中的液：期5无器离心#中g离心m吸清液联沉淀加56？TF游液（H8C）浮.R10您1手白嗨K（20川g/l）满3%湖浴用1OC氯化销得TA化销容液（头CTA和0/L家化爾）混，65温1cmir：加等供、就中英转源（体利比为24：1），混匀，13000离心10mn收上请液，加等外积赠一氯中只除本权比为2524：混3c00g商心10m地上清落，加0.6倍体异内萨，轻轻证台：离，服沉箱用头之萨清洗2次。「燥，加100液(18.0)辫新此鼠为NA液、不能立部检测，可保存20C名。按间样方法制备和性对照株和创作对照的株的增能波想依DNA。电可便用商业化的入A摄取试剂金并校其设H制备模板DNA.
3浓度和纯度的测定
项5LDNA落液汇小部虚举整率：，用核酸白分折仪成紫外分光光安计测260加和280m处的光密度值：NA的浓度接照成：计算：t-.A Nx 50/1 00
-NA浓度，单为微究询微升u：
A ---260 m处的度光信
N松应机释管数。
注：1D—m双学A，0出值41.71间时道增1.4泸增
10.4.1PCR度应依系（3l）：×PCR缓冲漫6TdNP0mmO/I)1.2uLTaDNA聚介(U/O.7模板DNA终教度V-FVRum/L0.引物GTXA-F和CTXA-RIG mO/各 O.6 物 TPAF 即 TCPAR0 anol/L) O,8 μTS物 LUSt-F1Pgt-R(0u/1.2水补.
10.4.2成条件：%：顾变：5mn：94变性3s537退火308，72c延钟30进行40个微环心延伸mi，4“俱存应产资。
10.A3将PCR物进行H分概
注：求反鹿教数可根据苏民广增发间的本同行消的洲整，10.5APLC检测bzxZ.net
10.5,1！PLC分新条件
05.1.1鱼谱t：PDVNAap谱.6nmia粒度3m)10,5.1.2住流.50%
10.5.1.3流动相（体积比）
0.Gmim.5.0路缓冲滋滋A，爆冲家液B0.5mn.c.2%缓冲落液A..8缔池满P--3.（mi22.0头线冲济没A1.名冲咨液B-5.5mi；39.4%缓冲游液A.0磁计溶液B一.0min.37.H与缓冲济液A2.3%13-10.5mn.36.0米缓冰济液A.01.9元市溶液13http
10.5.1.4流速：t.9/m..
SN/F 2562--2010
10.1.检测器资光教测器（光源：0w江激发浮宽m发射谱宽，5.3nm检测敏变：作波长351积分2）
10.5. 1,6洋量:(CR 产物16
10. 5。2分析
、1将装有PR产物的源征效索在金离极的微礼中115. 2.2登示DHP.分析系统热眠1逆借(P分新条件难检测序许选行试：分所条件可强据这器感改的不件站的谢。10.6威控对照设置
，检洲过量应分设型对照和谢性时股：阳对照为鼎1祥39祥群，（非130举的标注尚株。阳性对照为大肠添常国等敏脑南的标雅株11绮果及判断
11.1成控标准
11、1.1朗性对照；光吸峰出
11.2性刘照：出源的R物吸将，峰吸改大」3V11.1.不符合述对照质辞标群的视为无效，11.2制定与搬备
11.2.1检测结累的判定
112.1139群抓菌经PR机120b，304和20个片段的产物DHPLC可签测用该四个PCR产物源性波收峰2.12（群乱视给MPR可124b利H04b片段的，1HLC可检测较个PCR心物性吸收醛。
10139查乱张菌经增尚15个片般的产物，1可脸测出该·今PCR产物闻性吸收峰。
11.2.2结果搬备
11、2.2.1检测样品无MPR1P能度段峰出现。可判定格品结本为的格，接报告木检出箱弧脂
11.2.2.2检测梓品H鼎项型店（13群猴点案的M浪-1PIC产物四个阳快吸收峰，出整时间与划期致且吸改净值大于3mV时剂求滋样品结果为（39群征涨菌河疑性1.2.2.3检测伴品出现其或的0低阅为MRDTP产物个同性吸改峰。出格时间与则性对照一微，儿坡收峰但头于3V时，！划华结果为01群氛引弧菌可短阳性，1.2.检测样品现的19双的的H物个即性吸妆峰，出峰间性热-微，收收大3小，洲定该滚样品聚为作雅乱狐菌12”5检测详品吸改值小了小，议郑做，章做给案峰吸收伪小下3mV则为版菌到件，否则为乖乱驱菌可额性11.226对于省弧扇川区密果，府容员”10我做进-步的生化鉴定和波售。htti
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致病南名队
孔狐府
（好范限城）
食品中驱菌R务测所用引物序列
基因名球
茂原商区
食品中掌乱弧随M我HP心分群检测所用引物序列物名际
中跨序划
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GTXA : TTACT SAG AG GA TTGIT AtG G-3GTX4 R E ATE NT CTC TUI AGCCRC AT TA3TGPA F ETTG ACC CAA GGA GAA TGT AAG AC-SGTA R
S+ TA+TG YA ATY GAG CAG TTC CS' AGA TCT GTA A-G ATT GTA TTG AC-3AI N ACA AGT GAG ATA TCA AGC GTC Rhttp
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中华人民共利岗人竞检您检液
行业标湖
食品中需乱弧菌分群检测
MPCR-HFLC 法
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中标中顺社出版
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邮效编码：105
网址 spe. net. en
电话：852394868517548
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210年13月第版201C年0H-次刷
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0107--2922 L/NS
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