【国家标准(GB)】 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18090—2008
代替GB/T18090--2000
猪繁殖与呼吸综合征诊断方法
Diagnostic methods of porcine reproductive and respiratory syndrome2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T18090—-2008
本标准的修订参照了世界动物卫生组织（OIF）编写的陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、离与董蜂)(第五版，2004)。其技术内容与OIE所推荐的基本一致本标推代替GB/T18090—2000《猪繁殖和呼吸综合症诊断方法》。本标准与GB/T18090—2000相比主要变化如下：增加了临床诊断；
一-免疫过氧化物酶单层试验作连续4倍稀释，结果的判定按照OIE编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽与蜜蜂)》(第五版，2004)的内容作了相应的惨改；-增加了反转录骤合酶链反应试验。本标准的谢录A、附录B是规范性附录,附录C是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标推主要起草人:孙颖杰、苏永生、胡传伟、灵斌、李叶、受綫、肇惠君。本标推所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 18090--2000。
1范围
猪繁殖与呼吸综合征诊断方法
本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的诊断方法。本标准适用于猪繁蕴与呼吸综合征的诊断2规范性引用文件
GB/T 18090—2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修政单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励概据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规和试验方法（GB/T6682-·2008,ISO3696：1987,MOD）3特号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本标准。bp——碱基对;
CPE--—致细胞病变作用；
DEPC焦碳酸二乙酯；
dNTP脱氧核苷三磷酸;
EB 一溴化乙锭;
HRP一辣根过氧化物酶；
IFA——间接免疫荧光试验;
IPMA-一免疫过氧化物酶单层试验，PBS-—磷酸盐缓冲盐水；
PRRS～猪繁殖与呼吸综合征；
RNA--核糖核酸；
RT-PCR—反转录-聚合链反
Taq 酶一—Taq DNA聚合酶。
4临床诊断
急性感染初期，猪群表现为食欲低下、发热、睡和精神不振等症状，个别猪可出现双耳、外阴、腹部、口部背紫发，一-搬持续1周～3周；发病高峰的主要特征是母猪早产、流产以及木乃伊胎和弱仔增多；仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8周～12周发病末期，母猎繁殖功能逐渐恢复，达到或接近病前水平。仔猪和育爬猪存在不同程度的呼吸系统症状，疮愈猪一般牛长缓慢·休重较轻，若没有继发感染，除发病仔猪可见间质性肺炭等特征病变外，一般不表现肉眼间见病变。有以上临床症状者，可以怀疑猪群有猪繁殖与呼吸综合征病痒(PRRSV)感染，确诊需要实验室检验。
GB/T 18090-2008
5病毒的分离与鉴定
5.1材料准备
5.1.1器材
二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置牛物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞塔养板、微量移液器、组织研磨器、孔径0.2 m的微孔滤器皮滤膜。5.1.2拭剂
RPMI1640细胞培养液、MEM细胞培养液、续牛血清、肯霉索（10IU/tnL）与链毒素（10*μ/mL）溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。
5.1.3细胞
猪原代肺泡巨噬细跑培养物PAM)、MARET5TAM由未感架送PRRS猪群中6周龄～8周龄的猪获取，并经批次检验合格制和撤验方法见附录A。5.1.4样品
5.1.4.1采样
无菌采取扁桃休席更结和膜
，应改一20℃冰箱中·慢期保存应置5.1.4.2制备
血清和腹水可直接模测。肿,膜
成糊状，加人RPM摄制戏10%
500IU/mL链款
μg/rnL、庆
孔滤膜过液
样品，也可用0.2
5.2操作方法
5.2. 1制备细胞
已建文的某些猴肾细胞系不能
PAM细胞，先将PA胞用RPMI
素B10
大霖素 50 1μg/mL、商
MARC-I45用MFM使细胞
胞珺养板中。
5.2.2稀释样品
在空白 96 孔细胞培养
等组织可单
腋，以3.000/
分离探
特牛血清
展盒内立即送检。
不能立即检御者，
混合后检。馨组织剪碎后研磨
15min，吸最上满液，加人青游素200μg/m怀疑有细菌污染的
株的生长，此病毒分离应首选
100TU/mL链宽素100pμg/mL、庆为每毫升的×：个细胞。或将
后，每100红入到96孔细
确人细胞培养液RPMI1640，每孔90叫在A排和E排各孔内分别加人样品，每孔10μL(样品1静,将板轻轻摇动后，从A排和排孔各10叫L分别移入B排和F排孔内(样品1：100稀释)。羧轻轻播黏后，从B排和F排各取 L分别移人C排和G 排孔内（样品1：1000稀释）,将板轻轻摇动，从C排和G痱孔各取10分别移入D排和H排孔内（样品1：10000稀释）每个培养板应设置至自对照振动稀释板后加盖，置4℃C冰箱内保存备用。5.2.3接种样品
分别吸取上述稀释样品50拉.接种于5.2.1中对应的细胞孔（第---代)中,放入37℃、5%氧化碳培养箱中培养，每天观察CPE.连续观察2d～5d，5.2.4培养物盲传
一般在第一代培养 2 d 后,不论有无细胞病变,一律将每孔内细胞液取 25 μL,整板移入按照 5. 2. 1方法制备的新细胞板对应的孔内。放人37℃、5%二辑化碳培养箱中培养2d~5d，每天观察CPE。5.3结果判定
通常在接种1d～2d后可出现CPE，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。初次接种样品和育传后都出现CPE，或盲传后出现CPE钩认为阳性。仅仅初次接种样品出现CPE，认为是由于病2
合伙伴网http：/
料毒性引起的假阳性。
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在细胞培养物盲传结束后，不论是否出现 CPE，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)或间接免疫荧光试验(IFA)逃行终判：只要对PRRSV标准阳性血清是现阳性反应，则被认定为PRRSV分离阳性。
6免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）6.1材料准备
6.1. 1器材
微量移液器、倒置显微镜等。
6. 1. 2 试剂
6. 1.2.1IPMA诊断板的制备:见第 A, 6章。6. 1.2. 2 标准阳性血清,标准阴性血清和免抗猪 IgG HRP结合物使用前按说明-节规定用而清稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.3洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液按照附录B配制。6.1.3样品
采集被检猪血液,分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4或一20℃冰箱保存或立即送检。试验前格被检血清统一编号。6.2、操作方法
6.2.1稀释血清样品：在空板的A排和E排孔分别加人180μL的血清稀释液，其余各孔加120uL将20μL被检清和对照血清分别加入A排和E排各孔，缓慢摇动，从A排和E排各孔内取40uL分别加人13排和F排，依次作1：40.1=160、1：610稀释。6.2.2取上述板中稀释血清样品各50μI.如人IPMA诊断板的相应孔内，封板,37C孵育1h，弃去液休，用0.15mol/mL氛化钠（NaCI)十0.5%吐温-80洗板三次。6.2.3用0.15mnl/LNaC和0.5%吐温-80稀释免抗猪IgGHRP结合物至工作浓度，加入50μL结合物稀释液子板中，封板后3？解箭1五，洗涤三枕。6.2. 4各孔中加入显色剂/底物(AEC)溶波 50 μL,在 18℃～22℃室温下作用至少30 nin,弃去液体,加人 50 μL 0,05 mo1/LZ酸钠溶液。6.3结果判定
将IPMA诊断板置于衡置显微镜下判读，在对照样品成立的前提下，被检血清标本板内各孔约30%～50%的细胞质呈现深红色，判读为免疫过氧化物嗨单层试验阳性，记作1PMA（·+），细胞质未被染色，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA（一）。血清非特异性反应使整孔细胞染色（与阳性对照比较）。血清滴度以50%以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度10为阴性，10或40为弱阳性，非特异性染色常在此范围内，血清滴度≥160为阳性。7间接免疫荧光试验（IFA）
7.1材料准备
7.1.1器材
荧光显微镜二氧化碳培养箱，恒温箱、保湿盒、微重移液器等：7.1.2试剂
7.1.2. 1IFA诊断板的制备:见第 A. 7章。7. 1. 2. 2兔抗猪 IgG导硫氧酸荧光素(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清。7.1.3样品
被检血清应新鲜、透明、不溶血,无污染,试验前用 PBS作 20 倍稀释。3
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7.2操作方法
7. 2. 1在 96 孔板中每孔加入 PBS 190 μI ,再分别加人待检血清、阳性血清、阴性血清 10 μL(1 20稀释）。
7.2.296孔板IFA操作步骤
7.2.2.1取96孔IFA诊断板，加入150μLPBS，窄温浸润5min，弃去板中液体，并在吸水纸工轻轻拍下。
7.2.2.2在96孔IFA诊断板的感染和非感染细胞孔内分别加入50uL_7.2.1中瘀释的血清，封板后，盒中37℃作用30 min，弃去板中血清，在吸水纸上轻轻拍干。每孔加人PBS200μL，洗板六次，弃去液体，
7.2.2.3每孔加入工作浓度的兔规 IgG FITC结盒物50μL,在%C湿盒中作用30min。7.2.2.4弃去板中结含物，用BS洗涤四欲最后在吸求甄轻轻拍手用荧光晟微镜姚察。7.3结果判定
在对照血清成立的的體进行，即标滩阳性血清对照中感架细胞孔应出现典型的特异性荧光，而末感染细胞孔不出现荧光擦准性血清感染细胞孔不出现炎恶，感细胞孔绿色荧光，判为阿性
阿血清在
采样进行检测，重复验测为可疑，8间接酶联免疫昏验（间接EE）
B，1材料准备
8.1.1器材
96孔平底微量麻板、微量移神
8.1.2试剂
8.1.2.1PRRSV数正常细胞
俄航安说明书#
和标准阴性面淆。
8.1.2.2抗原稀释灌
8.1.3样品
森稀释液
抗猪IgG
胞孔均出现光。被检面清中未
细胞和感染继随中都没有特导性统重新检，或望周～3周后重新
（简称酶标抗体，标准阳性血清等的配制，见附录B。
被检血清应新鲜、透射
血、宪污染，试验前角血清稀释液作20稀释。8.2操作方法
8.2.1取96孔微量反应板手
数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加再作浓度的对照抗原，每孔100 μL,封板，置湿盒内 37 ℃恒温籍中感作gemina置4G冰稻内过夜8.2.2弃去板中包被液，加洗涤液洗板辑孔300μL，洗三次，每次1min。在吸水纸上轻轻拍干，8.2.3每孔加人封闭液 100 μl,封板后置凝盘内37温箱中感作 60 min 8. 2. 4 洗涤,方法同 8. 2. 2。8.2.5反应板缩号后，对号加人已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个满毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻，衔孔样量均为100。封板，置保屌盒内于37它但温箱中感作30 min。
8.2.6洗板，方法同8.2.2。
8.2. 7每孔加工作浓度的酶标抗体100 uI 封板,放保湿盒内置 37℃恒温箱中感作30 min。8.2.8洗板，方法同8.2.2。
8.2.9每孔加人新配制的底物溶液100±L，封板，在37℃恒温箱巾避光感作15mim。4
8. 2、10每孔加终止液 100 μL终止反应。8.3光密度(OD)值测定
在酶标测定仪读友做板各孔较的功值，记专用表格。8.4结果判定
8.4.1有效性判定
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阳性对照UD值与阴性对照OD值的差值应大于或等丁0.15时，才可进行结果判定。否则,本次试验无效。
8.4.2判定标准与解释
a）S/P比值小于0.3,判定为PRRSV抗体阴性,记作间接ELISA（一）；h）S/P比值太于或等于0.3,小于0.4,判定为可，记作间接EI.ISA（十）；c）S/P 比值大于或等于0.4,判定为PRRSV抗体阳性，记作间接 ELISA(十）。判定为可疑样品，可重复检测一次，如果检测结果仍为可疑，可判作阳性;也可以采用基他血清学检测方法进行检测。
注：间接ELISA试验也可采用经过验证的商品化检测试剂盒，9反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR）9.1仪器与器材
PCR检测仪，高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上),台式离心机(离心速度2 000 r/min),稳压稳流电泳仪和水平电泳糖，电泳凝胶成像系统（或紫外分析仪）混勾器，冰箱（2℃8℃和一20℃两种）微最可移薇器（10上L100L100oL及配套无RNA将背薄芯吸头Eppcndorf管9.2试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析，一级水、二级水符合GB/T6682规定的要求；本标准所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。a)PBS.见A.1.1,
裂解液：Tri-rcagcnt或其他等效裂解液；b)
三筑甲烷；
异丙醇：20℃预冷；
75%乙醇：见B.9.2;
DEPC 水:见 B. 9, 1;
M-MLV 反转录酶:10 U/μL;
5XRT缓冲液；
RNA酶抑制剂：40U/μL
j) Tag :10 U/μL:
10×PCR缓冲液(Mg2 full);
dNTPs:含有 dATP,dTTP,dCTP.dGTP 各 10 mmol/L;m)
甘油或矿物油；
n)引物:检测 PRRSV的引物对，参见附录 C,加DEPC 水配制成 100 μmol/L的储存液和20μmol/L.工作液；
0）电泳缓冲液:0.5XTBE缓种液，见第B.11章；p）电泳加样缓冲液：见第B.13章。9.3采样
9.3.1器械
下列采样工其应经(121土2)℃，15min高压灭幽并烘干：5
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棉拭了、剪刀,镊子,1.5 mL Eppendorf管、研钵。9.3.2样品
肺、扁桃体、淋巴结和脾等组织样品；新鲜精液或冻精液；血清、血浆、全而或细胞培养物。9.4样品制备
9.4.1组织
取待检样品 2.0 在研钵中充分研磨,加PBS混勾,冻融两次，4℃,以 3 000 r/min 离心15 min,取上消液备用。
9.4.2精液
冻融两次或超声波裂解，以10000r/min离心10min,取上清备用。9.5操作方法
9.5.1样品总RNA的提取
9.5.1.1取n个灭菌的1.5mLEppenrlor管，其中为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，编号。每管加人600μ细胞裂解液，分别加人被检样品，阴性对照、阳性对照各200L，每加--份样品换用个吸头,再各加入 200 μL氛甲烷,在猩勾器上振荡匀5 s。于4℃,以12 000 t/min离心15 mina9.5.1.2取与9.5.1.1相同数量灭菌的1.5mlEppcndorf管，加人500异闪醇（--20℃预冷），做标记。取9.5.1.1各管中的:清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500ul.不能吸出中间层），颠倒混勾。
9.5.1.3于4C、以12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）,小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地力沾干）；加人600μ75%乙醇，颠衡洗：
9.5.1.4于4℃、以12000r/min离心10min(Eppcndorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去1清，倒置于吸水纸上，尽景沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。9.5.1.5以4000r/min离心10s(Eppcndorf管开口保持朝心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面,室干燥 3 min,不能过于干燥，以免RNA不溶。9.5.1.6入11μLDEPC水，轻轻勾，溶解管壁上的RNA，以2000r/min离心5s，冰上保存备用提取的RNA应在2h内进行PCR扩增若长期保存应放置于一70℃冰箱内。9.5.2RT-PCR操作程序
9.5.2.1反转录
反应总20μL。依次在RT反应管中加人以卡反应物：a模板：提取样品的总RNA5μL：b下游[物P2:1μ;
e）5XR缓报液：4μL；
d) 10 mmal/L dNTP:2 μL,
RVA酶抑制剂:IμL；
f）M-MLV反转录酶:1 μL
g) DEPC水:6 μL。
以4 000 r/min离心20 s,放人PCR仪中,RT条件：42C、60 tmin,95℃、5 tnin9. 5.2.2 PCR扩增
PCR反应体系见表 1。
表1检测PRRSV基因的PCR反应体系组分
反转录产物
10× PCR 缓冲液
10 mmol/L dNTPs
10×氟化镁(25mmol/L)
上游引物P1(20 μmol/I)
下游引物P2(20μaol/1)
Tan酶 (5 U/μl)
加DEPC水至
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50L反应体系/
注：反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当的训整：没有热益的PCR仪器加人矿物油40HL。9. 5.2. 3PCR反应条件设置
各种试剂充分混合均匀后，以1000r/min离心30s，放人PCR仪中，设定PCR程序。，反应条件为95℃.5min，95℃、1min，51℃、1min，72℃、1min，35个循坏；72℃.10min。试验检测结束后，根据琼脂糖凝胶电泳来判断试验结果。9.6结果分析和判定
9.6.11%琼脂糖凝胶的制备
称取 1 多琼脂糖,刚人到 100 mL 0.5×TBE缓冲液中。加热融化后稍拎却到 40 ℃左右加 5 uL(10 mg/mJ)漠化乙锭,混匀后劑人放置在水平台面,L的凝胶盘中,胶板厚 5 mrm左右。依据样品数量选用合适型号的梳子，待凝胶冷却凝固斥拔出梳子（胶巾记形成加样孔),放人水平电泳槽中，加1×TBE缓冲液淹没胶面。
9.6.2加样
取～10PCR扩增产物和2μL加样缓液混匀后加人一个样孔。每次电泳应加阳性对照和阴性对照的扩增产物。并且设立DNA标准分子质量Miarker作分子质量大小对照。9.6.3电泳条件
电压 80 V~100 V,或电流 40 mA~50 mA,电泳时间 30 min~40 min.9.6.4结果观察和判定
a）在紫外灯下观察核酸条带并判断结果；b）PCR后阳性对照孔会出现一条372bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有核酸条书；c）待谢样品电泳后在相应372bpDNA位置[:有条带者为PRRSV核酸检测结果阳性；d）无条带或条带的大小不是372bp的为PRRSV核酸检测结果明性。必要时,可取PCR扩增产物进行序列测定，序列结果与已公开发表的PRRSV特异片段序列（参见附录C)进行比对，序列同源性在95%以上，可判定待测样品PRRSV核酸检测结果阳性，10综合判定
PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊应依靠实验室检查。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，RT-PCR适用于该病病原的快速诊断。血清学方法主要用于检测PRRSV抗体。IPMA、IFA和间接ELISA群体水平上进行血清学诊断较易操作、特异性强、敏感性高，但是对个体检测比较隔难，有时出现非特异性反应，但是在2周～4周后采血检测能够解决此间题，
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当在临床上怀疑有PRRSV感染时，可根据实际情况，由上述儿种方法中选用一种或啊种方法进行确诊,对丁未接种过 PRRS疫凿，经任何-·种方法检测旱现阳性结果时，都可最终判定为 PRRSV感染猪。对接种过PRRS灭活疫曲并在疫苗免疫期内的猪或已超越疫苗免疫期的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时,可终判为 PRRSV感染猪;当仪血清学试验呈阳性结果时,应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为PRRSV感染猪。8
kht tn:f foodmato
A.T试剂
附录A
（规范性附录）
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猪肺泡巨噬细胞（PAM制、鉴定、保存以及IPMIA，IFA诊断板的制备A.1.1磷酸盐缓冲盐水(PBS)
a）原液甲
氯化钢(NaC1)
氯化钾(KCI)
磷酸氟二钠(Na
磷酸二氢钾（
丁500m联
备用。
氯化镁店
一级水至
56 kPl
原液丙
氯化钙
溶于」
工作液
原液甲
原液乙
原液丙
充分混合
中，再
rin灭菌备片
一级水中
素 10°μg/l@
A.1.2 细胞生长液
加制菌素：
级水鑫800 薄L,56 kPa、20 min灭菌U/mL链链素10%μg/mL，庆大霉
a）含 10%犊牛血臂的MI1640 液（含青霖素 100 IU/、链霖素100 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL);
含 10%犊牛血清的MFM 液（臀呼爵素T00 IU/mL链霉素 100 μg/mL、庆大霉素b)
50 μg/mL).
A,1.3细胞冻存液
取细胞生长液 8. 0 nIL,加人分析纯二中基亚砜(DMSO)2. 0 mI.,混合均匀,不加制霉菌紊。A.2PAM的制备
敢6固龄8周龄的SPF猪或被证实无PRRSV感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用约200mLPBS从气管灌人肺，挤压灌洗3～4次，收集灌洗液，以1000r/min离心10min，齐上清液，沉淀物用50mLPBS再悬浮和离心洗涤2次～3次。最后的细胞泥用50 m1.细胞生长液悬浮,进行细胞计数,用细胞生长液稀释使细胞浓度达 4×10°个/1.5mL，所得新鲜巨赚细胞立即使用或定量分装后冻存。9
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A,3PAM的冻存
取细胞浓度为6×10？个/1.5ml.的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摄。用细胞冻存管分装，每管1.5mL，放70℃过夜，转人液氮中保存，液氮保存各批巨噬细胞,不可混合。A.APAM的批次试验
每批巨噬细胞应检验合格片再健用，方法是：在96孔细脑培养板上用已知滴度的标准病每感架巨细胞,并用标准的性血清和阴性血清进行IPMA或IFA测定。只有能支持特定滴度(TCIDs）的标推病毒良好牛长的巨噬细胞，方明用于试验。A.5PAM的复苏
从液氮中取出冷冻细胞管，立即投人温水(37℃左右)中迅速解冻。将细胞移人 10 倍量的RPMI1640液（pH7.2）中，以1000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，计数，稀释至要求的细跑浓度后，即可使用。A.61PMA诊断板的制备
a）将长满单层的PAM细胞用消化液消化后，用RPMI1640细胞生长液悬浮细胞，使细胞浓度达10°个细胞每10 L，在 96 孔细胞培养板中每孔分别排人100L,将细跑培养板放人37 ℃、5%二氧化碳培养箱中,培养 18 h～24 hb）用细胞营养液稀释PRRSV为10°TCIDsa/mL，每孔50μL，剩余2孔小加PRRSV作为对照孔。放人37℃、5%二氧化嵌培养箱中，培养18h～24hc）弃去培养液，用生理盐水洗涤细胞培养板，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍丁，37℃干媒45min，密封后储存于一20℃备用。加人冷的1%多聚甲PBS，室固定10min。用球冷的无水乙醇4℃固定45min，或冰冷的80%丙酮固定45min，弃去上述周定液用生理盐水洗涤次。
A.7IFA诊断板的制备
96孔IFA诊断板：在96孔细施培养板的2.4.6.8.10、12列分别加人50μL无血清的MEM细胞培养基；用细胞分散液消化MARC-145，用含8%FBS的MEM液稀释成每毫升10个，加人到上述96孔细胞培养板中，每孔150μL，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养至单层细胞备用；无血清的MEM培养基稀释PRRS标准毒，终浓度为105TCIDsn/mL，分别加到上述96孔细胞培养板的1、3、5、7、9、11列名孔内,每孔 50 μL。置 37 ℃C、5%二氧化碳培养箱中培养 48 h～72 h。弃去培养液,用 PBS洗--次细胞奔去 PBS后，每孔加人内150 μL，暨4 ℃作用30 min,弃去丙酮，案温于燥，密封于塑料袋内，“-70℃球箱中蓄用。
8孔IFA诊断板：细胞分散液消化MARC-145，用含8%FBS的MEM液稀释成每毫升105个，在8孔细胞培养板各孔中分别加人500L细胞悬液，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养至单层；用不含血清的MEM培养基稀释PRRS标准毒，终浓度为105TCIDsa/mI.,取50μL分别加到上述8孔细胞培养板中。暨37℃、5%二氧化碳培养箱中培养18h。弃去培养液，用PBS洗一次细胞，弃去PBS后，每孔加人两酮150μL，室温固定10min~15min，弃去内酮，案温干燥。密封，一70℃冰箱中保存。10
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