【国家标准(GB)】 蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18089-2008
代GB/T18089---2000
蓝舌病病毒分离鉴定及血清中和抗体检测技术
Isolation ,identification and serum neutralization antibodytest in Bluetongue virus
2008-12-31发布
中华人民北和国国家质量监督检验检妆总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T18089—2008
本标准代替GB/T18089-2000《蓝舌病微量血清中和试验及病分离和鉴定方法》。本标推与GB/T18089—2000相比主要变化如下：对标准名称进行了修改；
一删除了蓝舌病病毒鉴定中的病毒中和试验部分；增加了病市鉴定中RT-PCR方法的鉴定。本标准的附录A为规范性附录。
本标淮由中华人民共和同农业部提出。本标准由国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳山入境检验检疫局。
本标准主要起草人：周晓黎、杨建明、艾军、花群义、杨晓花、张其艳、严树发、董俊、叶玲玲、徐维加，本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18089—2000。
TYKAONIKACa
蓝舌痪病毒分离，鉴定及血清中和抗体检测技术
本标推规定了蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测的技术GB/T 18089—2008
本标准适用于尴盂病病毒的分离、鉴定及动物感染蓝否病病囊后血清中和抗体的检测。2符号和缩璐语
下列符导和缩略语适用于本标准。BHK
幼仓鼠肾细胞株；
乳糖蛋白陈缓冲肉汤；
蓝舌病；
碱基对；
致细胞病变作用;
蚊了细胞：
焦碳酸乙醋；
无特定病原体；
半数组织培养感染量；
非洲绿猴肾细胞株。
蓝舌病病毒分离
3.1材料
10 龄～11耳龄 SPF鸡胚
3.2设备与器材
鸡还开孔器、服蛋灯或艇蛋箱、乳体或组织捣碎器倒置显微镜。3.3试验程序
3.3.1样品bzxz.net
肝素抗凝血（每5mL血液用10IL肝素）、脏（肿、历，肾、淋巴结）、精液、库。用于病毒分离的样品应置冷容器中保存，在21h内送到实验案，并立即进行处理。3.3.2血液样品制备
取肝素抗凝血 5 mL,用磷酸趾缓液(PBS,配为见附录 A)洗涤血样 3 次-~4 次,每次 2 000 ±/min离心 1Cmin,弃上清液后加人倍量LP(配方见附录 A),置冰浴中用避声波处趣(10 μA、1 min)经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。3.3.3组织样品制备
无菌采集动物种,淋巴结,肝,俘各 g,剪碎后加人 BLP10 IniL(含青霉素 2 000 FU/nL,链霉素2000ug/ml），置乳体中研磨，4C冰箱中浸提4h，取上清液5nl用超声波裂解处理（100μA、1min-2 min)或冻融三次,3 000 r/min 离心 20 min,取上清液使用,使用前置 4 C保存,剩余样品置一70 ℃保存备用。
3.3.4精液样品制备
取精液样品0.5 trul.,用 BLP作15释后,3 000 r/min离心20 min;弃上清液，再用BLP作1
GB/T18089—2008
15释，充分混匀，置冰浴中用超市波处理（100μA，1min～2min）或冻融-次，3000/min离心20min，取上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。3.3.5库螺样品制备
取200个~300个库盛于小试管中，加人含青需素2000IU/mI链霉素2000g/mL的BLP3mL~5mL.置冰浴中研磨虫体，3ur/min离心20min，圾上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。
3.3.6鸡胚静脉接种
3.3.6.1选择10日龄～11日龄发育良好的SPF鸡压，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备用。
3.3.6.2在无菌条件下，每份样品樱种5个鸡还，每个鸡胚静脉接种，1.1L，接种后用擦镜纸时口，置33.5℃培荠
3. 3. 6. 3感H规察并记录4
存，于按种后第6关同末
3.3.7收毒
然烂的鸡胚为非特异性死亡,将h后瘾亡的鸡胚收置4C冰箱保二起收毒，
在无菌条件下，川酒酒精棉
膜片，敢出胚体，期露，在科个钵中研后，按1夏红BLP(含
日使用：剩余样品臂
C保存备，
3.3.8接种敏感点
3.3.8.1按带规量罩12孔细胞
3.3.8.2将收获上消液，按
？天换液后,培养
18孔细胞
3.3. 8.3按常规静
3.3.8.4第7大吸收下被按科
将欺下
3. 3. 8. 5
37℃培养。24h后
PCR试验进行监定；
蓝舌病病毒鉴定
澳察细胞驼
胞病变
4.1荧光抗体试验（直接法）
4. 1. 1 材料
龍单层，每份病将接科
细胞。
荧光标记的蓝舌病病毒单点隆抗体。4.1.2设备与器材
倒置炎光显微镜、96孔细胞培养板。4.1.3试验程序
壳，按膚规方剪破壳膜、尿膜、取病变缝织），翼组织捣碎器或乳μg/mL)4冰箱浸提4 h,当
孔接利c.1mL,靠 25C培养,第
单尽。
37C吸随11器，加入维持液骨
细胞病，则应进行灵光抗体、
4.1.3.1将接种的BIIK或Vera细胞培养物冻融：-次，1000r/mim离心10min，取上清液按种于带有玻片的24孔组织增养板的BIIK或Vero细拖单层，每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37℃吸附1h后咖人维持液，骨37℃培养72h。4.1.3.2取出培养板中的坡片，用0.0lmo1/LPBS漂洗-次，预冷芮酮固定75min。4.1.3.3每片滴加荧光标记的蓝舌病病毒单克座抗体，使其盖丁玻片，置暗湿盒中」37℃作用30 in。
4.1.3.4用0.01mol/LPBS洗片三次，再用蒸馅水洗片次。4、1.3.5风于，用碳酸缓冲甘油（配方见附录A)封片，荧光品微镜检查。2
TTKAONTKAca
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4.1.3.6结果判定：阳性对照的细胞浆内呈现颗粒状的黄缘色荧光，阴性对照应无荧光或无特异性荧光时，被检病毒接种细胞的细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。4.2聚合酶链反应(RT-PCR)
4.2.1试剂和材料
4.2.1.1引物(25pmo1/μL)：扩增NS1蛋白缩码基因RNA6保守序列，其引物序列和在RNA6基因中的位置如表1所示。
4. 2. 1. 2
4. 2. 1. 3
4. 2. 1. 4
4. 2. 1. 5
4. 2. 1. 6
4. 2. 1.7
4. 2. 1. 8
4. 2. 1. 9
4. 2. 1. 10
4. 2. 1. 11
Trizol。
-GTICTIIAPTGGCAACCACC-3T
NAGACTGTIRGECRT
5- AAGC
MT2TGAGAGAGUGA-3
CATACATTCCTTCCT-3
安度均芳
剂(40
U/μL)
PCR缓剂
4. 2. 1. 12
4. 2. 1. 13
4. 2. 1. 14
4. 2. 1. 15
随机号
三氯中
主要仪器和
mmal/L)
(TBE)：
溶液(10ma
配方见附录
质垦标准
K醇、
高速冷冻离心机量
4.2.3试验程序
4.2.3.1.样品的采集与处
不同样品参照4. 3. 2~4
4.2.3.2对照样品制备
在RNA6 中的位置
283--264
170--189
27G--250
、凝胶电冰仪、水平电泳精、凝胶管理系统微晟慧波器5的处理学法
4.2.3. 2. 1阻性样品:接种病毒的细脆增物4.2.3.2.2性释品：正常细胞培养物。4. 2. 3. 3RNA 的提取
除本标准规定的方法外，也川采册其他等效的RNA提取方法，具体操作见有关试剂说明书。4.2.3.3.1取250 μL处理后的样品置1.5 mI,Fppendnrf管中,作好标记,加入 3倍体积Trizol,振药混合 20 s,静置 5 min
4.2.3.3.2加入200μL三氯甲烷，振荡混含20，静置5min。4.2.3.3.34℃12000z/min离心15tnin，取上置另一个标记好的1.5mLEppendorf管中；加入等体积另丙醇，—20℃静置15 mir1。4.2.3.3.44℃12000r/mi离心15min，轻轻弃上清加1mL、DEPC水配制的75%乙醇;4℃3
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12000r/min离心I5min，小心弃去艺醇，倒置滤纸上：烘于，文即进行cDNA的合成或一20℃保存备用。
4. 2. 3. 4cDN4 的合成
以下所有操作应在冰盒工进行，4.2. 3. 4. 1 RNA 的变性
在沉淀核酸的Eppedatl管中依次切人：随机引物，2u;DEPC水，12μI，轻微振，瞬时离心;70℃作用10 min，冰浴2min;3000 r/min,离心1 min。4.2.3,4.2反转录
在超净台内于Eppcndorf 誉(4.2.3.4.1)中依次加人：5X反转录酶缓冲液,4 μL;dNTPs,1 μLRNA酶抑制剂,0.5 μL;AMV反转录酶,0.5 μL瞬时离心.42 C作用 1 h;70 ℃作用 15min;冰浴3 min,立即进行 PC尺扩增或一20 ℃保存备用4. 2. 3. 5 PCR反应
在--PCR管中,依次加人以下试剂:10×PCR缓洲,5L;氯化镁，3L;dNTPs,μL:TagDNA案合嗨,0,5 μL;引物1,1 μL;引物 2,1 μL;cDNA,4 μL;ddH,0;34.5 μl瞬对离心，骨 PCR 仪内运行下列程序:5C预变性 3min;95 ℃30 s,55℃30 s,72 C 30 ,运行35个环;72,10 min;4 %,保存
套式 PCR扩增(Neaterl PCR扩增）：养一PCR管，依欲加人以下试剂：l0×PCR液，5L;氯化镁.3L;NTP$.1μL；TDNA聚合酶,0.5 μl;物3,1 μ引物4,μ第次扩蹭产物,1,，dd,0,7μI时离心，置PCR仪内运行下列程序：95℃预变性3n;95℃305：55℃30s.72%30，运行30个循环；72℃，1Cmin;4，保存4.2.3.6PCK产物的检测
4.2. 3. 6. 1 1.5%琼脂糖凝胶的制备见附录 A。4.2.3.6.2加载样品：取两次扩增产物各10μL与载样缓滚混合，分别加人胶孔中。忆压5V/cm-8V/cm,良泳 30 min-in mir;紫外检测仪下观察结果、照像。4.2.3.7结果判定
4.2.3.7.1第-次FCR扩增后，阳性对照应出现条274bp的DNA条带。阴性对照和空对照没有核酸条带，
4.2. 3. 7. ？ 第二次 PCR扩增后,阳性对照应出现 条 101 hp 的 NA 条带。阴性对照和密口对照有核酸条带。
4.2.3.7.3在阳性样品第一次FCR扩增或第二次 PCR扩增山现月的核酸条带，而阴性对照和空白对照均成立的情况下，进行检测样品的判定：4.2.3.7.4待检样品第-次扩增经电冰出现274hp的DNA条带，或第二次扩增经电泳能出现101bp的 DNA条带,均川判为阳性。
4.2.3.7.5得检样品两次扩增经电泳均未出现DNA条带，判为阴性。或者出现的条带不是274bp和101b，为非特异性反应，需重复试验，两次试验均为非特另性反应时，判为阴性。5蓝舌病病毒血清中和抗体检测
5.1试剂和材料
5.1.1病毒;监舌病病藓 1~~24 血精型国际标准再株。5.1.2对照血清：蓝舌病标准阳性血清、阴性血清5.1.3被检血清：采巢缩羊等反动物血所分离的血清，一20℃保存。5.1.4细跑:C6/36,BHK.或Vero.
TrKAONTKAca=
5.1.5培养液：配方见附录A。
5.1.6维持液/稀释液：配方见附录A，5.2设备与器材
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二氧化碳培养箱、冰箱（一20 ℃保存血清，一70 ℃保存种毒）,倒置显微镜,96孔细胞培养板、单头利多头微量移液器(20 μL～200 μL)。5.3试验程序
5.3. 1 病毒繁殖
将监舌病病毒1-24(BTVi-2)型分别接种于 BHK,或 Vcro 细胞单层,37 ‘C吸附 h 加入维持液，置5%二氧化碳(CO:)培养箱培养,逐目观察。得CPE达75%以L，收获病毒悬液除融或超声波处理，以2000上/min离心20mit1分装成1niL/瓶，置一70℃保存备用：5.3.2每价测定
将各型病毒在96孔板工作10°～1010稀释，每个帮释度作8孔，再孔病毒悬液为50L，加入细胞悬液150μL每毫升3×10″个细胞），每块板设8孔细胞对照。置5%CO，培养箱37℃培养，逐日观察并记录CPE按Karber方法计算山各邮清型病游的TCIDso/50ul..5. 3.3灭能
监舌病标阳性血清、阴性血清、被检血清经thb C 30 min 灭能。5. 3. 4 对照
细胞对照：设4孔正常细胞对照，即每孔加细胞悬液100μL（每毫升3×10°个细跑）、稀释液100 pL。
-阴性而清对照:设4扎阳[对照,孔加阴性血清和100 TCID，/50μL病毒悬蔽各50L,再加人细胞悬激100L（每紫升3×105个细胞）。-病毒回归对照：将各病毒稀释成1000、100.10、1TCIDso/50rL.每个稀释度作4孔，每孔加人50μL病毒悬被,再加入细胞悬羧100μL(每升3×105个细胞）,每补充稀释液50μL。---阳性血瘾对照：将阳性血清分别作1：4、1：8、116稀释，每个稀释度作4孔，每孔加名稀释度阻性血清利1001:/50u病带悬液各50μ，再灿人细胞悬液100M每毫升3×10个细。
血清性对照：每份被检血消应按稀释度各设一孔序性对照,每孔各加各稀释度血清0nI、稀50ul和100μl.细胞悬液。
5.3.5中和试验
5.3.5.1 将每份被检血清作1 :1、1 ：81：16释释,每个稀释度作 5 个孔,每孔加各稀释度血清50μl.
5.3.5.2第 1孔作为血清毒性对照,加入稀释液 50 μL和细胞悬液100 μL(每毫3×105个胞)5.3.5.3第2孔～第5孔为止式试验孔，每孔加人病荐悬液G0μL(1anTCIDs/50μl)，振葛3mim~5 min,置 37 ℃中和1 h;加细胞悬液 100 μL(每密升 3×10°个细胞）5.3.5.4置37C、5%CO培养箱培养，24h后逐日观察CPE并进行记录，培养7d5.3. 5.5 结果判定,当病声回归 1.000,100,10 TCID/50 μL 全部出现 CPE,1 TCID/50° μL 出现50%CPF：阳性、阴性、正常细胞、血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，判定时间为72h～168h。被检血清孔50%出现保护，判为阳性，如低于50%判为阴性。当某份血清的某：稀释度出现50%保护时,该血消释度即为该份血清的中和抗体滴度，当中和抗体滴度1：8耐狗为阻性。6蓝苦病病毒感染检测综会判定标准在检测巾，蓝舌病病毒分离、鉴定与血清中和抗体试验应同时进行，任何一种方法为阳性，均可判定均蓝苦病性，
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A. 1 0. 01 moI/L PBS,pH7. 2~pH7. 4磷酸氢一钳
磷酸二氢
氯化钠
蒸馏水
A2乳糖蛋白陈缓冲液肉汤（BIP)A2.1A液的配制
磷酸二氢钠（元水）
兰藜水
A 2.2B液的配制
磷酸氢一钠（无水）
三蒸水
A, 2. 3工作液的配制
谢录A
（规范性录）
溶液配制
1.034×ICi Pa 15 min 高压灭菌或抽溅除荫.A.3碳酸缓冲甘油
A,3.10.5 mal/I.PH9.5碳酸缓冲液的配制碳酸氢钠
碳酸钠（无水）
蒸馏水
A.3.2H汕。
A.3.3磁酸缓冲甘油的配制
1份碳酸缀冲液加9份甘汕混合即成。A.45×Tris-硼酸(TE)电泳缓冲液Tris
0. $ mol/L. FDTA(pH8. 0)
三蒸水定睿至
充分溶解，4C保存。
A.510mg/mL溴化乙锭溶液
誓告-
本品为强致癌物，使用时需小心！漠化乙锭
三蒸水
TTKAONTKAca
1 000 mL
1G0onL
220 mL
1 000 ml.
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置棕免瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铅箔包裹容器，保存于室温：A.6DEPC水
十三蒸水中按0.1头加人DEPC，案温静置过夜，1.034×10Pa高压20min，冷却备用。A.71.5%琼脂糖凝胶的制备
在200mL三角烧瓶中加入：电冰级琼脂糖,1.5g;0.5×TBE缓冲液,100mL。置微波炉中使之完全溶解后，加入10mg/mL澳化乙锭溶液5ul充分摇勾，备用；待琼脂糖冷却到60℃右，倒人制胶板并防正气泡产生，使琼脂糖原度达3mm～5mm；待凝胶完金凝固后去掉梳子和两端封口物，将凝胶托盘放入电泳槽，旭人0.5×TBE出泳缓冲液使之高出胶2tmm~3mm。A.8营养液
199培养基，灿人含10%无监舌病病声抗体胎牛血清;抽滤除菌：A.9维持液
199培养基，加人含2%无蓝百病病毒抗体胎牛血清：抽滤除菌。A.10细胞分散液
乙二铵四乙酸二钠(EDTA)
无钙镁PI3S
抽滤除菌。
1 000 mL
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