【农业行业标准(NY)】 乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法

ICS 67.120.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1663—2008
乳与乳制品中β-乳球蛋自的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法
Determination of β-lactoglobulin content in milk and dairy producisSDS-PAGE electrophoresis
2008-07-14发布
2008-08-10实施
中华人民共和国农业部发布
本标准中附录A为资料性附录。
本标准山中华人民共科国农业部妆业司提出。本标准山全国奋妆业标准化技术委员会归！本标准起节单位：农业部食品质量监督检验测试中心上海）NY/T1663-2008
本标滩主安起人：而虚、货菲菲、炜突奕、贝榕、陈美莲、何亚斌、王建年、韩惠雯I
1范围
乳与乳制品中B-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法
本标滩规定了乳与乳剖品中R乳球蛋占的 SLSPAGE凝咬电泳测定方法：NY/T 1663- 2008
标准适用丁乳与乳制品(牛牛乳、奶粉、液态乳、奶酪、乳清粉)中β-乳球蛋的测定。本标准液态样品的检出限24mg/100n山，阅液态和固体样品的检出限240mg/100g2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标滩的弓川的成为不标准的条款：凡是注日期的而文件，其随后所有内修改单（不包括勘误的内穿）或修订版均不适用十本标准·然而，鼓励根括本标准达成协议的各方研究是否可使月这些文件的般新版。凡是不注口期的引屏文件,其最新版小适川十本标准，CB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
试样用STS-PAGE凝胶电冰后，光案度计对3-乳球蛋白行测定分折，求得3-乳球蛋FI的含。
4试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂：实验用水应符合GB/I66名2中一级水的规定。
4.1冰酪酸(CH.COOII)
4.2磷酸(H,P()）
4.3硫酸铵(NI)SO
4. 4过硫酸鞍（(NH.）:SO)）
4.5醇（CHOH
4.6乙醇（(CIOH)
4. 7 两=醇(G110)
4. 8 七氨龄(CH,NO)
4.9三羟甲基氨4甲烷（C.H:NO）：作化级4.10β基之醇(CHI.())生化级
4. 11丙烯酰胺(CIT.O)
V-甲叉双内稀酰胺(C.H.N2O):生化级4.131：烷基碰酸钠（CH.S()Na)：生化级4.14N,>,N,-μIF基乙二胺(HN.）;生化级4.15溴酚临(CHiBr.O.5)
6考马斯蓝R-2559
NY/T16632008
4.17盐酸溶液
Ar0i/L.量取36ml.浓盐酸（HC1)注人50mL水中，定容至100tmL.混匀。4.18丙烯酰胺单体贮备液
准确称敢14.53g丙酰胺（4.11）.0.15g>N巾叉效内烯醚按（4.12）.先用40mL水溶解.搅拌，直溶藏变澄清透明，再用水稀释至50ml，过滤，备用，该备液在4℃下棕色瓶中可保存-个月。注；内烯酰鞍串体都是中枢祖经毒物，小学操作。4.19浓缩胶缓冲液贮备液，1mol/L,pH6.8雅确称取6.c6g羟甲基氨盐烷（4.9），溶解于10m水中，用盐酸溶液（4.17)游节p至6.8形用水定容至0mI.4℃下保存。
4.20分离胶缓冲液贮备液，1.5mol/L,pH8.8准确称取 9.08g一羟巾基复基巾烧(4.0),溶链于40rL水中,用盐酸溶液(4.17)调节pH尘8.8质,用水定容尘0L，C保存。
4.21过硫酸铵溶液，100g/L
准确称取 0. 1 g过硫酸铵(4. 4),加 1 rnl. 水溶解,使用前能制,4.22十二烷基磺酸钠溶液，100g/L准确称取5十二烷磺酸钠（4.13),用水溶解定容至50m！.,案温保存4.23N,N，,N-四甲基乙二胺溶液，体积分数为10%量取0.10mL..N,N,V'-四巾基乙二胺(4.12),加水稀释定容至1.00mL。4.24样品缓冲液，0.08mol/l
精确称取4mg溴监（4.15)，溶解于a.00trl.水中、分别量取1.60mL激缩胶缓冲液贮备液（4.19）4.00=L1二烷基磺酸钠济液（.22）、1.20ml.8-硫基乙醇（4.10）、2.20tml.内三（4.7），全部混合后用水稀释定容至20m!.,1℃保存。4.25电极缓冲液，pII8.3
分别准确称取3.0*：甲基氨4甲烷（。9）、14.4乌日氨酸（1.8），加人十二烷基磺酸钠溶澈(4.22)10 mL,谢节 pH至8. 3.定容至 _ 0c0 mL。4.26考马斯亮蓝染色液,2.5g/L
称取0.25g考5期亮蓝尺-250（4.16)和10硫酸铵（4.3).分别加人20ml.乙醇（1.6）10ml.磷酸（4.2).溶解混匀，用水定容至100rmL，4.27脱色液
分别量取75 mL冰酷酸(4. 1),50 m!.F醇(41.5),875ml.水，混勾4.28-乳球蛋白标准溶液，1.00mg/ml精移0.0100g8-乳球蛋标准品（纯度90%），用样品缓冲液（4.24)定容尘101L.满水浴加热3mir-~5 min,在一20℃:以下保存5仪器设备
常用实验案仪器及以下各项。
5.1天感量c.c001
5.2电泳仪。
5.3电泳槽，100mm×83mm
5.4光率度打措仪。
5.5微量江射器，10.
5.6离心机，不低于73001/min，5.7糍力搅拌器
5.8其塞离心试管。
6分析步骤
6.1试样制备
6.1.1液体样品
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取1mL样品，依次加人1mL水和2nL样品缓冲液（4.24),沸水浴加热3mii-~5rrin，磁力揽排器(5.7)搅半4h,离心5tmin，除脂肪,取上清液分装，在-23℃保存，备用。6.1.2固体样品
称取1 g样品,精确到C. 1 mg,加适量水溶解,定容至13 milL..按6.1.1操作。6.2分离胶制备
按表1制12%分离胶20 mL,泥匀后加人到长、知玻均板间的缝隙内，约 60 nim-~73mrm 高，沿长玻璃板板壁缓慢注人约tmtn高的水，进行水封：约30 mnin后，凝陵与水封层间出现折射率不同的界线.则表示凝胶完全聚合：倾倒去水时层的水，再川滤纸条吸去多余水分。6.3浓缩胶制备
按表1配制3%浓缩胶10mL，混匀所加到已聚合的分离胶上方，直至距离短坡璃板1缘约5mrml处。轻轻将样品槽模板插人浓缩胶内，约30 nin后凝胶聚合.放置20 min~30 imitr,使凝胶老化。表1不连续电泳的凝胶配方【垂直电泳)广液
，内烯酰胺单体此备液（.1B）
浓缩收缓布液贮备液(1.19)
分离胶缓冲液贮备液(4.20)
十：烷片磺酸钠溶液（4.22)
,NN-正甲基乙二胺溶液(1. 23)
过硫设溶液（1.21）
6.4装槽
3六浓缩胶
2. $2 nl.
12关分离胶
水平取出梳子，将胶板垂直放人电泳槽巾，并灌入新配置的电极缓冲液（.25）凌没玻璃板1边缘，胶板底部不要有气液。
6.5上样
用微量进样器分别加人乳球蛋[标准游液(4.28)2L和试样(6.1)2L。6.6参考电泳条件（恒电流）
浓缩胶巾浓缩39拍A;分离胶巾分离30A6.7染色
剥湛的凝胶而水清洗-次,这泡在盛有考马斯亮蓝染色液(.26)的器Ⅱ中,染色12上。6.8脱色
色片的凝胶先用水冲洗表而的多余染料，再用脱色液（4,27)浸泡脱色。史换脱色液，至凝胶背景无色止
6.9分析
用光密度汁对凝胶进行测定分析据光密度值计算3-乳球蛋的含量，典型图谱参见附录A：3
NY/T16632008
7结果计算
诚样中3-乳球蛋白含最以质量分数X计：数值以毫完每百克或毫克每百毫升（irg/100g或ing/100 ml.表示.按式(1)计算：
式中：
试祥辫液中3乳球蛋白的光密度值：2
Xfx100
标准济液中乳球蛋白的浓度，单位为毫克每毫（tn/ml)；样品定容体积，单位为毫升（:nL)；9-乳球蛋标溶液的光密度值：
试样的上样体积,单位为微升(L)-乳球强白标涟溶液上样体积，单位为微升（)；稀释倍数：
试样的质量.单位为克（g），
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留一位有效数字注：标雅曲线的科关系数10.99
8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术半均值的1%在再现性条件下获得的两次独记测定结果的绝对差值不得超过算术勾值的15%。(1)
..........
附录A
【资料性附录】
凝胶电泳法测定的-乳球蛋白典型图谱A.1凝胶电泳法测定的β-乳球蛋白典型图谱见图A.1。z
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图A：1
凝胶电泳法测定的β-乳球蛋白典型图谱NY/T16632008
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