【商检行业标准(SN)】 进出口食品中α-硫丹和β硫丹残留量的检测方法 酶联免疫法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2094—2008
进出口食品中α-硫丹和β-硫丹残留量的检测方法
酶联免疫法
Determination of a-endosulfan and β-endosulfan residuesin foodstuff for export and import-Enzyme linked immunosorbent assay method2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
本标准附录A和附录B为规范性附录，附录C和附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、天津科技大学。SN/T2094—2008
本标准主要起草人：郑文杰、王硕、张宏伟、张燕、贺艳、刘烜、林安清、赵卫东、魏亚东、吴延晖。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
进出口食品中α-硫丹和-硫丹残留量的检测方法酶联免疫法
本标准规定了进出口食品中α-硫丹和3硫丹总残留量的酶联免疫测定方法，SN/T2094—2008
本标准适用于粮谷、蔬菜、茶叶、烟草、水果、肉及肉制品、虾中硫丹残留量的筛选检测。鱼类不适用酶联免疫法的测定，用胶体金试纸条法测定，方法见附录B。2测定方法
2.1方法提要
用甲醇或丙酮提取样品中α-硫丹和β硫丹，用竞争性酶联免疫法进行检测2.2试剂和材料
除另有要求外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水2.2.1甲醇。
2.2.2丙酮。
2.2.3亚铁氰化钾0.36mol/L。
2.2.4硫酸锌溶液1.04mol/L。
磷酸氢二钠（NazHPO,12HO)。
磷酸二氢钠（NaH,PO·H,O)。
氯化钠。
无水醋酸钠。
β环糊精。
过氧化氢脲
3,3°，5,5'-四甲基对二氨基联苯。二甲基亚矾。
磷酸盐缓冲液（pH7.4）：见附录A。吐温-20。
无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。0.5%鱼皮胶水溶液（保存4℃保存）。掩蔽剂稀释液：0.5%鱼皮胶：磷酸盐缓冲液（1：20，体积比）稀释，于使用时配制。溶液1:甲醇：掩蔽剂稀释液（1：10.体积比）。酶标记物：辣根过氧化物酶和半抗原的结合物，4℃保存，于使用时用磷酸缓冲液40倍稀释，酶标物稀释8h后不能继续使用。2.2.20
洗涤液，见附录A。
底物液A,见附录A。
底物液B,见附录A。
终止液：硫酸1.25mol/L。
α、β硫丹混合标准品（英文名称：α、βEndosulfan、CAS代码：115-29-7）：纯度大于等于99.5%。标准品贮备液：配制成1ug/mL甲醇贮备液，一20℃保存。1
SN/T2094—2008
低温保存试剂，放置于室温不要超过4h，使用时，各溶液应达到室温。2.3仪器和设备
2.3.1粉碎机。
旋涡混合器。
2.3.3气浴摇床。
2.3.4酶标仪。
2.3.5市售硫丹检测试剂盒。
2.3.6氮吹仪。
2.3.7单道微量加样器：20μL.100μL，200μL2.3.8多通道微量加样器：200μL。2.4，制样
2.4.1蔬菜（大白菜、蒜、葱、商蒿、小松菜、甘蓝（绿、紫）、卢笋、姜、菠菜、胡萝卜、芹菜）：称取5g（精确到0.01g）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，机械振荡（250r/min）1h。室温静置分层，吸取200uL上清液用掩蔽剂稀释液稀释10倍后进行测定，胡萝下稀释15倍；芹菜稀释20倍。2.4.2粮谷（红豆、绿豆、毛豆、花生）：称取10g（精确到0.01g）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加人50mL甲醇，机械振荡（250r/min)1h。室温静置分层，吸取200μL上清液用掩蔽剂稀释液稀释20倍后进行测定。
2.4.3茶叶：称取5g（精确到0.01g）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，机械振荡（250r/min）提取1h。室温静置分层，吸取100μL上清液用掩蔽剂稀释液稀释900倍后进行测定。2.4.4烟草：称取10g（精确到0.01g）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加人50mL甲醇，机械振荡（250r/min)1h。静置10min，吸取100uL上清液用掩蔽剂稀释液稀释200倍后进行测定。2.4.5肉类（牛肉、羊肉、鸡肉）：称取10g（精确到0.01g）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加人20mL甲醇涡旋剧烈混合2min，过滤，吸取200μL上清液用掩蔽剂稀释液稀释10倍后进行测定。2.4.6虾：称取10g（精确到0.01g）待测样，搅碎后加入20g无水硫酸钠搅勾，再加入20mL丙酮、200μL1.04mol/L硫酸锌溶液和200μL0.36mol/L亚铁氰化钾，涡旋混匀2min；于4800r/min离心5min。取全部上清液氮吹至干；加入50%甲醇水溶液8mL，充分溶解，滤纸过滤。虾样的标准曲线用阴性样品提取液配制。
2.5酶联免疫法检测
2.5.1标准曲线的制备bZxz.net
用溶液I稀释10μg/mL的硫丹标准溶液储备液至100μg/L，用溶液I对100ug/L的硫丹标准溶液进行1：3梯度稀释，得到一系列不同浓度的硫丹标准溶液（100μg/L，33.3μg/L，11.1ug/L，3.7μg/L,1.2μg/L0.4μg/L)。2.5.2样品测定
在酶标板中分别加入100μL不同浓度的硫丹标准溶液和样品待测液，在空白和对照孔中分别加入100uL的水。除空白孔外，在每个孔中加人100μL的酶标记物稀释液，空白孔中则加入100uL磷酸盐缓冲液.轻拍混匀，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，室温孵育60min。弃掉酶标板中的液体，用洗涤液洗板3次。加入混合好的底物液150μL，轻轻混匀，室温放置30min后，每个孔加人50μL的终止液，轻轻晃动酶标板，10min内在酶标仪上读出每孔450nm、650nm吸光值2.6结果的计算
2.6.1计算抑制率值
测定不同浓度硫丹对抗原抗体结合反应的抑制率见式（1)：IC=[1-A品二A100
1A对照—A室白一
式中：
IC—硫丹对抗原抗体结合反应的抑制率，%：A对期———450nm吸光值与650nm吸光值的差值；A群品
硫丹标准液或样液的平均吸光度值；A至白
不加人酶标及硫丹标准液的平均吸光度值。2.6.2绘制标准曲线
SN/T2094—2008
以抑制率为纵坐标，硫丹浓度对数为横坐标绘制校正曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线，见图1。
*博证
浓度/pph
图1硫丹标准曲线
2.6.3结果计算
从图1绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的硫丹浓度（c），按式（2)计算试样中的硫丹残留量：X-cXRXM
式中：
试样中硫丹残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；根据样品孔的抑制率查得试样中硫丹浓度，单位为微克每升（ug/L)；某类样品换算系数，系数见表1：调整待测定液浓度使其在标准曲线范围内所稀释的倍数。表1不同类样品的换算系数值
牛肉、羊
肉、鸡肉
检测低限、回收率
3.1检测低限
大白菜、蒜、葱、茴蒿、
小松菜、甘蓝、芦笋
本方法检测低限见附录C。
3.2回收率
胡萝卜
硫丹添加浓度和回收率的实验数据见附录D。芹菜、绿豆、红小
豆、花生
....(2)
SN/T2094—2008
A.1磷酸盐缓冲液
5×磷酸盐缓冲液：
附录A
（规范性附录）
50mmol/L磷酸盐一0.9%氯化钠pH7.4磷酸氢二钠（NazHPO·12H,O)
磷酸二氢钠(NaH,PO,·H,O)
氯化钠（NaCI）
调pH值至7.4。
用水定容至1L。
于4℃保存。
使用时，溶液应达到室温，用水1：5稀释。A.2
洗涤液
5×洗涤液：
5X磷酸盐缓冲液
10%吐温-20
磷酸氢钠(NazHPO,·12H,O）
磷酸二氢钠（NaH,PO,）
氯化钠（NaCI)
加水定容至1L，室温保存3周4周使用时，用水1：5稀释。
3底物液
底物液A
无水醋酸钠
β环糊精
过氧化氢脲
调pH值至5.0。
加水定容至1L。
于4℃保存，使用时需达到室温。A.3.2
2底物液B
3.3.5,5-四甲基对二氨基联苯（TMB）二甲基亚矾（DMSO）
使用前室温避光保存。使用时，按底物液A：底物液B为32：1（体积比）混合使用。B.1样品提取
附录B
（规范性附录）
鱼中α-硫丹和硫丹总残留量的检测方法胶体金试纸条法
SN/T2094—2008
称取2g（精确到0.01g）待测样，切碎后加入3g无水硫酸钠搅匀.再加入8mL甲醇，涡旋混匀1min。过滤后氮吹至干，再加人4mL含10%甲醇的磷酸盐吐温溶液稀释液待测、2检测
将胶体金标记硫丹抗体原液与抗体稀释液按体积比1：2混合，取120μL样品提取液，加入30μL金标抗体稀释液混匀。取140L上述混合液滴加到试纸条包被区域，待液体完全流过后，在质控线显色的情况下，目视检测线的颜色。将限量样品管加入含10%甲醇的磷酸盐吐温溶液400μL，溶解混匀，以此试剂代替样品待测液按上述方法操作，作为限量对照，样品测试带颜色比限量带浅，则判断为样品中硫丹含量超过限量。
检测低限
检测低限4μg/kg。
SN/T2094—2008
胡萝卜
大白菜
甘蓝(绿）
甘蓝（紫）
小松菜
附录C
（资料性附录）
酶联免疫方法的测定低限
酶联免疫方法的测定低限
检出限/（μg/kg）
100~120
400~480
红小豆
检出限/（μg/kg）
100~120
100~120
100~120
100~120
200-240
45004900
1000~1200
胡萝下
大白菜
甘蓝(绿）)
甘蓝（紫）
小松菜
添加水平/ppb
附录D
（资料性附录）
硫丹添加浓度和回收率
硫丹添加浓度和回收率
回收率/%
红小豆
添加水平/ppb
SN/T2094—2008
回收率/%
SN/T2094—2008
Foreword
The Annex Aand B of this standard is normative annex.The Annex C and D is informative annex.This standard was proposed byand is underthe chargeof Certification and Accreditation AdministrationofthePeople'sRepublicofChina.This standard was drafted by Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic of China,Tianjin University of ScienceandTechnologuy.This standard was mainly drafted by WenjieZheng,Shuo Wang,Hongwei Zhang,Yan Zhang,YanHe,XuanLiu,WeidongZhao,Weidong Zhao.Anqing Lin,YadongWei,Yanhui Wu.This standard is a professional standard promulgated for the first timeo
SN/T 2094—2008
Determination of aα -endosulfan and β-endosulfanresidues infoodstufffor export and import-Enzyme linked immunosorbent assay methodScope
This standard specifiesthemethodsof determinationby ELiSAmethodof aβendosulfan residues infoodstuffsforexportandimportThis standard specifies the methods of determination by ELiSA method of aβendosulfan residues ingrain,vegetables,fruit,tea,tobacco,meat and meat products.aquatic for import and export.And themethod of determination of fish is colloidal gold strip see Annex B.2Methodof inspection
Principle of determination
a .β endosulfan is distilled by methanol and acetone The basis of the test is the competitive enzyme-linked immuno-reaction.
2.2Reagentsandmaterials
In this standard,all the chemical reagents should be analytically pure and\water\ is double distilledwater.
Methanol.
Acetone
FerrousKCN0.36mol/L
ZnSO1.04mol/L
NazHPO·12H,O.
NaH, PO4 ·H2O.
SN/T 2094—2008
β-cyclodextrin.
Hydrogen peroxide urease.
3.3'.5.5'-tetramehty-benzidineDMSO.
Phosphatebuffer（pH7.4）SeeAnnexATween-20.
o.5%fishskingelstoreat4℃
Teatudoreagent:0.5%fishskingel:phosphatebuffer(1:20.V/V).ReagentI:methanol:teatudo(1:10,V/V).Enzymeconjugate:horseradishcatalaseandsemiantigen,storeat4℃,diluted 4ofold withphosphatebufferwhenused.Thediluted solution isuselessafter8h.2.2.20
Wash reagent seeAnnexA.
Substrate A,see Annex A
Substrate B,see Annex A.
Stopsolution：H,SOa1.25mol/Lα-Endosulfanandβ-Endosulfanstandard（CAscode：115-29-7).Prepared standard solution:1 μg/mL methanol,store at -20 ℃All solution must be stored at low temperature and never be placed at room temperature longer than4h，reachroomtemperaturebeforeuse.2.3
Apparatus and equipment
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