【商检行业标准(SN)】 进出口食品中绿脓杆菌检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2099-2008
进出口食品中绿杆菌检测方法
Determination of Pseudomonas aeruginosa in food for import and export2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
本标准的附录A、附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2099—2008
本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：郑晶、黄晓蓉、赵贵明、翁国柱、吴芸芸、郑麟毅、陈彬、邵碧英。本标准系首次发布的出入境检验检疫标准I
http://foodmate.net1范围
进出口食品中绿脓杆菌检测方法本标准规定了食品中绿脓杆菌的定性和定量检测方法本标准适用于各类食品中的绿脓杆菌检测，可参考此法检测水的绿脓杆菌。规范性引用文件
SN/T2099—2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28—2003食品微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
绿脓杆菌属假单胞菌属（pseudomonas）亦名为铜绿假单胞菌，具荚膜、鞭毛，为无芽胞的革兰氏阴性杆菌，能分解蛋白质，发酵糖类能力较低，能产生两种水溶性色素：一种是绿脓菌素，为蓝绿色的盼嗪类化合物，无荧光性，另一种为荧光素，呈绿色。4设备和材料
4.1恒温培养箱：36℃±1℃、42℃。4.2显微镜：带油镜头。
4.3均质器。
高压灭菌器
4.5天平：精度0.1g。
4.6VITEK全自动微生物鉴定系统或类似设备注：VITEK是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4.7吸管：1mL，分刻度0.1mL;10mL，分刻度1mL。4.8可调移液器：10μL~100μL.100μL~1000μL。4.9试管：15mmX100mm。Www.bzxZ.net
4.10灭菌平Ⅲ：直径90mm，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。4.11灭菌的样品处理器具：镊子、剪刀、勺子。4.12质控菌株：绿脓杆菌标准菌株ATCC9027，恶臭假单胞菌ATCC49128或其他经过验证的具有相同生物学特征的同类菌株。
5培养基和试剂
除另有规定外.所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定，5.1SCDLP增菌液：见第A.1章。
5.2磷酸盐缓冲稀释液：见第A.2章。1
h
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假单胞菌CFC选择性培养基：见第A.3章。假单胞菌CN选择性培养基：见第A4章。氧化酶试验：按GB/T4789.28-—2003中3.18规定。乙酰胺培养基：见第A.5章。
葡萄糖酸盐培养基：见第A.6章。精氨酸双水解酶培养基：见第A.7章。硝酸盐蛋白陈水培养基：见第A.8章。明胶培养基：见第A.9章。
赖氨酸脱羧酶培养基；见第A.10章。营养琼脂：见第A.11章。
API20NE测试条。
5.14GNI+测试卡。
注：API20NE测试条和GNI+测试卡是由法国生物梅单埃公司提供的产品的商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。6检验程序
6.1方法提要
食品中绿脓杆菌的检验方法是通过选择性增菌、分离、生化鉴定等方法对食品中可能存在的绿脓杆菌进行定性和定量的检验。
6.2检验程序
绿脓杆菌的检验程序见图1。
样品25毫(25ml.）
225mL灭菌牛珊素水《D)W）或磷酸盐缓冲格释液[ml. 转种10 rml.SC:D1.P增肉汤3x3管36C±I 24h121
按种 CIC:和 CN平摄
225mLSCDL1增菌液
3611f:24h+2h
36℃±I℃24h±2h
挑选凝菌落，按种营养琼啃斜而36=It 18h--24h
节兰民,染位，氧化降试验
AP[20NI,GNI-鉴定
报古结来
御耕酸
酸盐选
报告结果
图1绿脓杆菌检验程序示意图
http:
7检验步骤
7.1样品的存放
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如为冷冻样品，应于2℃~5℃解冻，且不超过18h，若不能及时检验，应置于小于-15℃保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，并在24h内检验。7.2绿脓杆菌定性检验
7.2.1按无菌操作取检样25g（25mL）至225mLSCDLP增菌液中，充分摇匀，于36℃士1℃培养24h±2h。
7.2.2接种SCDLP增菌培养物按7.4进行分离鉴定。7.3绿脓杆菌定量检验（MPN法）7.3.1无菌操作取样品25g（25mL），放人灭菌均质杯或均质袋中，加225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液，均质混匀制成1：10稀释液。7.3.2用10mL灭菌吸管吸取1：10稀释液10mL加人装有90mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲稀释液的广口瓶中，混合均匀，制成1：100稀释液。7.3.3每一稀释度换取一支10mL灭菌吸管，按上述操作进行10倍递增稀释。7.3.4根据对样品污染情况的估计，选择三个连续适宜的稀释度。每个稀释度接种三管SCDLP肉汤，每管接种1mL。样品的最高稀释度应达到能获得阴性终点，置36℃土1℃培养24h土2h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面通常有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。7.4分离鉴定
7.4.1分离培养
每份增菌液用接种环分别划线接种于CFC平板和CN平板，置36℃土1℃培养24h土2h，观察菌落形态。绿杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取5个可疑菌落，分别接种到营养琼脂斜面上，36℃士1℃培养18h～24h，取纯培养物进行鉴定。7.4.2氧化酶试验
挑取斜面上的纯培养物，按GB/T4789.28—2003中3.18进行氧化酶试验，绿杆菌氧化酶试验呈阳性。
7.4.3革兰氏染色
挑取斜面上的纯培养物按GB/T4789.28—2003中2.2进行革兰氏染色，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。
7.4.4鉴定
革兰氏染色阴性、氧化酶阳性的培养物应用API20NE测试条、VITEK生化鉴定系统或按7.4.5~7.4.11进行生化鉴定。
7.4.5乙酰胺试验
挑取斜面上的纯培养物，接种到乙酰胺培养基中，置36℃士1℃培养24h士2h，培养基不变色为阴性，红色为阳性。
7.4.6葡萄糖酸盐试验
挑取斜面上的纯培养物，接种到葡萄糖酸盐培养基中，置36℃士1℃培养24h土2h，加0.5mL班氏糖定性试剂.混匀，煮沸1min，冷却后观察。蓝色为阴性，黄色或砖红色沉淀为阳性7.4.7精氨酸双水解酶试验
挑取斜面上的纯培养物，接种到精氨酸双水解酶培养基中，置36℃土1℃培养24h士2h，培养基不变色为阴性，红色为阳性。

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7.4.8硝酸盐还原产气试验
挑取斜面上的纯培养物，接种到硝酸盐还原陈水培养基中，置36℃士1℃培养24h士2h，小倒管中有气体者，即为阳性。
7.4.9明胶液化试验
挑取斜面上的纯培养物穿刺接种到明胶培养基中，置36℃士1℃培养24h士2h，取出放2℃~8℃冰箱10min～30min，仍呈溶解状为明胶液化试验阳性，凝固不溶为阴性。7.4.10赖氨酸脱羧酶试验
挑取斜面上的纯培养物，接种到赖氨酸脱羧酶培养基中，置36℃±1℃培养24h土2h，黄色为阴性，紫红色为阳性。
7.4.1142℃生长试验
挑取斜面上的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在42℃培养24h～48h，能生长为阳性。
假单胞菌属细菌生化特性
特性见表1。
表1假单胞菌属细菌生化特性
生化试验
氧化酶
乙酰胺
葡萄糖酸盐
精氨酸双水解酶
硝酸盐还原产气
明胶液化
赖氨酸脱羧酶
42℃生长
绿脓杆菌
注：十表示阳性；一表示阴性。7.5结果报告
荧光假单胞菌
恶臭假单胞菌
施氏假单胞菌
7.5.1定性检验结果报告：符合表1中生化特性，或API20NE和VITEK生化鉴定为绿杆菌，报告样品中是否检出绿杆菌。
7.5.2定量检验结果报告：符合表1中生化特性，或API20NE和VITEK生化鉴定为绿脓杆菌，根据每一稀释度的阳性管数差MPN表（见附录B），计算并报告每克（毫升）样品中绿脓杆菌MPN值。全品试伴网httn：
A.1SCDLP液体培养基
A.1.1成分
酪蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
卵磷脂
吐温-80
蒸馏水
pH7.2±0.1
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基
1000mL
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将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装适宜容器，121℃高压灭菌20min。A.2磷酸盐缓冲稀释液
A.2.1贮存液
A.2.1.1成分
磷酸二氢钾
蒸馏水
2制法
用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2.用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱中。
A.2.2稀释液
用蒸馏水稀释1.25mL存液至1000mL，分装于适宜容器，121℃高压灭菌15min，备用。假单胞菌CFC选择性培养基
基础培养基
A.3.1.1成分
蛋白陈
硫酸钾
氯化镁
十六烷三甲基漠化胺
丙三醇
蒸馏水
pH7.2±0.2
1000mL
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2制法
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH.加入琼脂，加热溶解，分装适宜容器，121℃高压灭菌15min，备用。
A.3.2CFC添加剂
A.3.2.1成分
十六烷三甲基溴化胺
头孢菌素
夫西地酸
A.3.2.2制法
取无菌水和无水乙醇各1mL混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。A.3.3使用方法
待基础培养基冷却至50℃左右，每500mL基础培养基加人2mL添加剂，倾注无菌平板。A.4假单胞菌CN选择性培养基
A.4.1基础培养基
A.4.1.1成分
蛋白陈
水解酪蛋白
硫酸钾
氯化镁
蒸馏水
pH 7.1±0.2
A.4.1.2制法
1000mL
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH，加人琼脂，加热溶解，分装适宜容器，121℃高压灭菌15min，备用。
A.4.2CN添加剂
A.4.2.1成分
十六烷三甲基溴化胺
A.4.2.2制法
取无菌水和无水乙醇各1mL混合均勾.将上述成分溶解于混合液中，摇匀，备用。A.4.3使用方法
待基础培养基冷却至50℃左右，每500mL基础培养基加人2mL添加剂，摇匀后倾注平板5乙酰胺培养基
A.5.1成分
乙酰胺
氯化钠
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
硫酸镁
蒸馏水
1000mL
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pH 7.2±0. 1
A.5.2制法
将上述各成分加热溶解，调节pH.分装小试管，121℃高压灭菌20min，备用A.6葡萄糖酸盐培养基
A.6.1成分
蛋白陈
酵母粉
磷酸氢二钾
葡萄糖酸钾
蒸馏水
pH 6. 8~7.2
A.6.2制法
1000mL
将上述各成分加热溶解，调节pH.分装小试管，116℃高压灭菌20min，备用。精氨酸双水解酶培养基
A.7.1成分
酵母粉
葡萄糖
氯化钠
L-精氨酸
溴甲酚紫
蒸馏水
pH 6.7±0.1
2制法
1000ml
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除溴甲酚紫外，将其他成分加热溶解煮沸，调节pH，加人溴甲酚紫，混匀，分装小试管，121℃高压灭菌10min，备用。
硝酸盐蛋白陈水培养基
A.8.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
硝酸钾
亚硝酸钠
蒸馏水
pH7.2±0.1
A.8.2制法
1000mL
将蛋白陈和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热溶解，调节pH，煮沸过滤后补足液量，加人硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混勾，分装到加有小倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，备用。A.9
9明胶培养基
A.9.1成分
牛肉膏
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蛋白陈
蒸馏水
pH 7.4±0.1
A.9.2制法
1000mL
将各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加热使溶解，调节pH.分装于试管内，115℃高压灭菌20 min，直立制成高层备用。A.10
赖氨酸脱羧酶培养基
A.10.1成分
酵母粉
葡萄糖
L-赖氨酸
溴甲酚紫
蒸馏水
pH 6.7±0. 1
A.10.2制法
1000mL
除溴甲酚紫外，将其他成分加热溶解煮沸，调节pH，加人溴甲酚紫，混匀，分装小试管，121℃高压灭菌15min.备用。
营养琼脂
A.11.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
pH 7.2~7. 4
A.11.2制法
1000ml
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH，加人琼脂，加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成斜面备用。
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附录B
（规范性附录）
绿脓杆菌最大可能数（MPN)检索表表B.1接种量为0.1g(mL）0.01g(mL）、0.001g(mL）时三管法的MPN表MPN
阳性管数
阳性管数
注：如果接种量扩大十倍，分别为1g（ml）0.1g（mL)、0.01g（ml)时，表中数字相应缩小十倍。如果接种量缩小十倍分别为0.01g（ml）、0.001g（ml）、0.0001g（ml）时，表中数字相应扩大十倍9
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开本880×12301/16印张1字数19千字2008年9月第一版2008年9月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-19086
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—660/NS
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