【商检行业标准(SN)】 入出境人员猴痘检验规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2097—2008
入出境人员猴痘检验规程
Codes for examination of monkeypox at entry-exit port2008-07-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-02-01实施
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2097—2008
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国惠州出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：幸芦琴、李小波、钟玉清、阮力、师永霞、郭波旋、黄吉城、洪烨、相大鹏、郑萝本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
入出境人员猴痘检验规程
SN/T2097—2008
本标准规定了入出境口岸人出境人员猴痘病毒的实验室检验方法与结果报告，包括样本采集、处理，检验程序、方法，结果判定及报告本标准适用于入出境口岸猴痘病毒的实验室检验2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
monkeypox
由猴痘病毒（monkeypoxvirus）引起的人兽共患传染病，临床主要表现有高热、头痛、背痛、全身不适、咳嗽、淋巴结肿大，伴全身出现类似天花的皮疹，偶尔出现腹痛。2.2
实时荧光
PCRreal-timefluorescencePCR
实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收：PCR扩增时，利用Tag酶的5，-3，外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和率灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。2.3
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数3仪器和设备
需要如下仪器设备。
Roche荧光定量PCR仪；
生物安全柜；
高压灭菌器；
普通冰箱；
一普通台式离心机（带密封的离心安全杯）；一冷冻离心机（带密封的离心安全杯）；一研钵；
涡旋器。
4试剂
4.1核酸提取试剂：使用TakaRa基因组DNA提取试剂盒”详见说明书4.2Hot-StartMixmaster反应试剂盒购自Roche公司\。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1
SN/T2097—2008
4.3灭菌双蒸水。
4.4实时荧光PCR检测的引物和探针F3L-F5-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3F3L-R5-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3F3L-P-MGB5'FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT-MGBNFQ-3'。5样本采集
5.1皮疹、痴皮采集：取皮疹上盖或痴皮，装入2mL的灭菌塑料管里，密封，4℃或4℃以下保存运输。5.2水疱液、脓疱液采集：用附有注射针的一次性注射器吸取0.2mL的PBS，从疱膜插人，来回2次~3次混匀后吸取内容液，把吸取的内容液装入血清管，4℃或4℃以下保存运输。5.3全血采集：静脉采集疑似病人抗凝全血5mL，4℃或4℃以下保存运输6样本处理
使用TakaRa基因组DNA提取试剂盒制备病毒核酸。6.1提取试剂准备（在使用前进行）溶液A、溶液B若出现沉淀，于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。6.2病毒核酸提取步骤
6.2.1样本制备
6.2.1.1皮疹、痴皮等病变组织：取1mg~100mg的病变组织移人冰浴预冷的研钵中，快速用力研成勾浆（富含胶原蛋白的皮肤等组织需加液氮研磨至粉末状）；加入650μL的溶液A和0.9μL的RNaseA1，温和研磨30s；收集650uL研磨好的组织匀浆移至收集管中，如果匀浆不足650μL，补充溶液A至650μL，65℃水浴5min。
6.2.1.2水疱液、脓疱液及病人血液：取250uL的水疱液、脓疱液及病人全血（含抗凝剂）加人收集管中；加人500μL的溶液A；加人1μL的RNaseA1.激烈振荡15s后，冰浴5min。6.2.2加入400μL的溶液B，振荡混合。6.2.3加入1mL的4℃预冷的溶液C，充分混匀后，12000r/min离心2min6.2.4弃去上层有机相，再加人1mL的4℃预冷的溶液C.充分混匀后，12000r/min离心2min。6.2.5弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于收集管上的滤杯中，12000r/min离心lmin
6.2.6弃滤杯，在溶液中加入400uL的DB缓冲液，混合均匀。6.2.7将试剂盒中的离心柱子安置于收集管上，将上一步的混合溶液转移至离心柱子中，12000r/min离心1min，弃滤液。6.2.8将500uL的RinseA加人至离心柱子中,12000r/min离心30s，弃滤液。6.2.9将700μL的RinseB加人至离心柱子中，12000r/min离心30s，弃滤液。6.2.10重复7.2.9操作次。
6.2.11将离心柱子安置于新的1.5mL离心管上，在离心柱子膜的中央处加人50μL的ElutionBuffer，室温静置1min。
6.2.1212000r/min离心1min洗脱DNA。7实时荧光PCR检测
7.1实时荧光PCR反应液的制备：设置20μL反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无菌水11.25μL；
25mmol/LMgClz2.4μL；
-20μmol/LF3L-F0.75μuL;
—20μmol/LF3L-R1μL;
10μmol/LF3L-P-MGB0.6μL;
Hot-start mix 2 μL;
模板2μL。
7.2PCR反应条件：95℃10min；95℃10s.60℃30s（single)50循环8结果判断
SN/T2097—2008
使用Roche荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线（baseline）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。
8.1实时荧光PCR反应系统的质量控制：反应结果应同时符合以下2个条件，否则实验结果无效一阴性对照无扩增曲线，为阴性。一阳性对照Ct小于35并有明显扩增曲线8.1.1阴性：无Ct值或Ct大于等于45，且无明显扩增曲线，报告为猴痘病毒核酸荧光PCR检测阴性。
8.1.2阳性：Ct值小于等于40，并有明显扩增曲线.报告为猴痘病毒核酸荧光PCR检测阳性。8.1.3Ct值在40～45之间的样本建议重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该样本判断为猴痘病毒核酸荧光PCR检测阳性，否则为阴性。8.2本方法的检测灵敏度为10°copies/reaction，检测效果最佳模板浓度范围为10t～10°copies/reaction。
9结果报告Www.bzxZ.net
阳性样本结果报告：猴痘病毒核酸荧光PCR检测阳性。阴性样本结果报告：猴痘病毒核酸荧光PCR检测阴性。10
生物安全措施
根据中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，猴痘病毒危害程度分类为1类，所有有关猴痘病毒的实验室操作应按照以下规定执行。10.1猴痘病毒培养应在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行。10.2未经培养的感染性材料的操作应在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行。10.3猴痘相关的灭活材料操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行10.4无感染性材料的操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行10.5猴痘感染性材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。
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