【国家标准(GB)】 变性淀粉中乙酰基含量的测定 酶法

ICS67.180.20
中华人民共和国国家标准
GB/T20373—2006/IS011213：1995变性淀粉中乙酰基含量的测定
Modified starch--Determination of acetyl content-Enzymatic method(ISO11213:1995,IDT)
2006-03-14发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2006-10-01实施
中华人民共和国
国家标准
变性淀粉中乙酰基含量的测定
GB/T20373—2006/ISO11213：1995*
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2006年11月第一版2006年11月第一次印刷*
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GB/T20373-—2006/ISO11213：1995本标准等同采用ISO11213：1995《变性淀粉中乙酰基含量的测定构与ISO11213：1995—致。
本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由中国商业联合会提出。本标准由中国商业联合会商业标准中心归口。一酶法》（英文版），其内容和结本标准起草单位：江南大学食品学院、吉林淀粉批发市场、中国淀粉工业协会变性淀粉专业委员会。本标准主要起草人：顾正彪、洪雁、张燕萍、陈洪兴、钟立满、周心怡，EkhttnFaodatono
1范围
GB/T20373—2006/ISO11213:1995变性淀粉中乙酰基含量的测定
本标准规定了用酶法测定颗粒和冷水可溶性变性淀粉中乙酰基含量的方法。可测定总的和游离的乙酰基含量，通过计算得结合的乙酰基含量。本方法适用于测定乙酰基含量不超过质量分数为2%的样品。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法ISO1666：1973，淀粉——水分含量测定——烘箱法3原理
总的乙酰基含量测定是加热含有稀盐酸的样品，水解乙酰基成醋酸和溶解淀粉。在乙酰辅酶A合成酶（ACS)的存在下，三磷酸腺苷（ATP)和辅酶A（CoA）将醋酸转换成乙酰辅酶A，在柠檬酸合成酶(CS)的作用下，后者再与草酰乙酸反应生成柠檬酸盐。草酰乙酸是由苹果酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I,NAD)在苹果酸脱氢酶（MDH)作用下反应生成的。在这个反应中，辅酶I被还原成NADH，生成NADH的量可以通过其在某一特定波长下的吸光值增加而测定。
游离的乙酰基含量测定是将变性淀粉分散在水中形成悬浮液、过滤，按照上述方法测定过滤液中的乙酰基含量。结合的乙酰基含量则为总的乙酰基含量减去游离的乙酰基含量。4试剂与材料
除注明的以外，所用试剂应为分析纯。所用的水应完全符合GB/T6682规定的二级。所用的酶应与BoehringerMannheim酶质量相当。注1：可用适当的商用酶试剂盒。4.1盐酸(HCI)溶液
c1mol/L
4.2氢氧化钠(NaOH)溶液
c=5mol/L。
4.3缓冲溶液
在大约70mL蒸馏水中，溶解下列试剂：7.5g三乙醇胺（三羟乙基胺）；420mgL-苹果酸；
210mg氯化镁（MgCl·6H,0）。
需加入大约8mL5mol/L的氢氧化钾溶液，使缓冲液的pH维持在8.4。此溶液在4℃下，可稳定贮存一年。wwW.bzxz.Net
GB/T20373—2006/IS011213：19954.4ATP-CoA-NAD溶液
在20mL水中，溶解下列试剂：
500mgATP-Na2H2-3H2O(质量分数为98%）；500mg无水碳酸氢钠（NaHCO,）；50mg冷冻干燥的CoA三锂盐（CoA的质量分数约为85%）；250mg冷冻于燥的游离β-NAD一水化物（β-NAD·HzO的质量分数>98%）。该溶液在4℃下，可稳定贮存一周。4.5MDH-CS分散悬浮液
分散约1100U(国际单位）的苹果酸脱氢酶（MDH来自于猪心，酶学编号为EC1,1.1.37）和约270U的柠檬酸合成酶（CS来自于猪心，酶学编号为EC4.1.37)于0.4mL浓度为3.2mol/L的硫酸铵［(NH),SO,溶液中。
该溶液在4℃下，可稳定贮存一年。注2：在25℃下，一个国际单位（1U)1min可催化1μmol的底物。4.6ACS溶液
溶解20mg冻干的并含有5mg乙酰辅酶A合成酶（ACS来自酵母，EC6.2.1.1,约16U)于0.4mL水中。
该溶液在4℃下，可稳定贮存5天。5仪器
5.1锥形瓶：250mL，带螺旋帽。5.2沸水浴：带振荡器。
容量瓶：200mL。
5.4微量移液器或注射器。
分光光度计：能在340nm波长处操作。5.5
比色杯：石英玻璃或其他在340nm处可透光的材料，厚度为10mm士0.1mm。5.6
试验筛：孔径为800μm。
螺旋式磨粉机。
水浴：20℃~25℃。
6样品的制备
将样品过孔径为800μm筛（5.7）。样品不能通过筛子部分，再用螺旋式磨粉机（5.8）研磨，至其全部通过800um筛。充分混匀样品。7操作方法
7.1乙酰基的水解
7.1.1颗粒状淀粉的分散
称取约1g（精确至0.001g）待测实验样品，置于250mL锥形瓶（5.1)中，加入50mL盐酸（4.1)，搅拌至较好的分散状态。后续步骤见7.1.3。7.1.2预糊化淀粉的分散
加50mL盐酸（4.1)至250mL锥形瓶（5.1)中，在锥形瓶中加人搅拌子后，置于磁力搅拌器上开始搅拌，缓慢并小心地加人约1g（精确至0.001g)待测实验样品，确保样品的分散均匀。7.1.3水解和过滤
将锥形瓶盖上塞并放人沸水浴中(5.2)，振荡30min。2
GB/T20373—2006/IS011213:1995取出锥形瓶，放人冰水浴中快速冷却至20℃士5℃。完全冷却后，打开塞子，加人10mLNaOH溶液（4.2），混匀。将样品转移至200mL的容量瓶（5.3）中，用蒸馏水定容。将容量瓶放置于20℃～25℃的水浴（5.9)里（淹没刻度线），使温度平衡。用合适的滤纸过滤，弃去最初的20mL～30mL滤液，其余作为7.4所示的酶法测定溶液。
7.2游离乙酰基测定
7.2.1颗粒状淀粉的分散
称取10g待测实验样品，边搅拌边加人装有100mL蒸馏水的锥形瓶（5.1）中，后续步骤见7.2.3。7.2.2预糊化淀粉的分散
在锥形瓶（5.1)中加入100mL蒸馏水，放人磁力搅拌器的搅拌子并开始搅拌，缓慢并小心地加人约2g（精确至0.001g)待测实验样品，确保分散均匀。7.2.3溶解和过滤
盖上锥形瓶塞子并振荡30min。将样品转移至200mL的容量瓶（5.3）中，用蒸馏水定容。将容量瓶放置于20℃～25℃的水浴（5.9）里（淹没刻度线），使温度平衡。用合适的滤纸过滤，弃去最初的20mL～30mL滤液，其余作为7.4所示的酶法测定溶液。7.3验证实验
为验证本方法，可以用纯的无水醋酸钠等试样作参考。称取约100mg（精确至0.1mg）无水醋酸钠（乙酰基的质量分数为52.4%），放人1000mL容量瓶中，用蒸增馏水定容，将容量瓶放置于20℃~25℃的水浴（5.9)里（淹没刻度线），使温度平衡，后续步骤见7.4。7.4乙酸的酶法测定
根据以下的分析测试条件进行乙酸的酶法测定：波长：340nm；
温度：20℃~25℃
比色杯（5.6)中装有蒸馏水为参照，读取吸光值。注3：也可以在下列波长下进行测定，但计算中要考虑摩尔吸光系数×Hg灯.365nm:X-3.4L.mmol-1.cm-1-Hg灯，334nm:=6.18L.mmol-.cm将一定体积（见表1)的样品放于比色杯（5.6)中进行测定。表1乙酸酶法测定的分析方案
试剂和作用量
缓冲溶液(4.3)
ATP-CoA-NAD溶液（4.4)
双重蒸馏水
待测落液
混合每个比色杯中的样品，读出吸光值A。。在每个比色杯中加人MDH-CS悬浮液（4,5)
样品浴液
混合每个比色杯中的样品，3min后读出吸光值A。在每个比色杯中加人下列试剂，让其反应ACS溶液(4.6)
混合每个比色杯中样品，等反应停止（大约需用10min15min），读出吸光值A2。如果15min后反应不能停止，每隔2min读吸光值一次，直至每2min吸光值增加幅度不变。注：样品溶液的体积可以根据乙酸基的含量的高低适当调节，但最终总的体积应维持在3.23mL。3
GB/T20373—2006/ISO11213:19958结果计算
8.1吸光值之差
通过式(1)计算出吸光值之差：
式中：
(A,-A),-
(A2 -A), -
(A, -A,),
吸光值之差；
(Ar-A)
(A2—A)。—
(A,-A.）)
通过表1中的各分析条件下测出的吸光值；A.AA
含有样品的溶液；
b—空白溶液。
8.2总的乙酰基含量
通过式（2)计算出总的乙酰基含量：W.
一待测样品中总的乙酰基质量分数，%；100
100-wm
根据8.1所计算出的吸光值之差；-NADH在340nm处的摩尔吸光系数，x=6.30L·mmol-1.cm-1，一待测样品的质量，单位为克，g)（见7.1.1或7.1.2）；（1）
.（2)
-样品中水分质量分数，%。
当样品溶液的份额不等于在表1中所示的0.50mL含量时，公式需要作相应的调整。因待测溶液被定容至1000mL而不是200mL(见7.1及7.2），因而，要考虑验证实验（7.3)的稀释5倍。注4：公式的推导列于附录A。
8.3游离乙酰基含量
通过式（3）计算出游离乙酰基含量：W=
式中：
100-wm
待测样品中游离乙酰基质量分数，%；AA、x和w.的含义与8.2相同；
待测样品的质量（见7.2.1或7.2.2），单位为克，（g）。m
8.4结合乙酰基含盘的测定
通过式（4)计算出结合乙酰基的含量：Whe
9精密度
待测样品中的结合乙酰基质量分数，%；待测样品中总的乙酰基质量分数，%；待测样品中游离的乙酰基质量分数，%。...(3)
（4）
方法的精密度由ISO/TC93/WG3在1990年组织的化学基础实验室合作实验中确定，并贯彻执行符合GB/T6379（参见参考文献[27）。这次实验有11个实验室参与进行：样品为玉米变性淀粉，马铃薯变性淀粉，小麦变性淀粉。这次实验统计结果的摘要参见附录B。当重复限和再现限确定时，其置信度为95%。
9.1重复性
GB/T20373—2006/IS011213：1995在很短的时间间隔内，在同一实验室中由同一实验者采用同样的仪器、同样的材料、同样的方法进行的两个独立的实验结果的绝对差值不应超过两个结果中较高值的5%。9.2再现性
在不同实验室由不同实验者采用不同仪器、相同材料、相同方法进行的两个独立实验得到的绝对差值不应超过两个结果中较高值的8%。10
实验报告
实验报告要列出：
参考的标准；
取样方法；
一实验方法；
-得到的实验结果，
若重复性已被核对，最后获得的结果。还应提及在本标准中所有的未列出的或非必要的操作细节，还要写出任何偶然的可能影响实验结果的细节。
实验报告需包括彻底确认样品的所有必要的资料。EhttnFeoatone
GB/T20373-2006/ISO11213:1995附录A
（资料性附录）
乙酰基含量计算公式
通过式（A.1)可以计算得到待测溶液中总的乙酰基质量浓度(g/L)：M,X V,X AA
1000xVxdxx
-待测溶液中总的乙酰基的质量浓度，单位为克每升(g/L)；M,—-乙酰基的摩尔质量，M,=43g/mL；V,--待测溶液的体积，Vi-0.50mL；V。—样品溶液的最终体积，V，=3.23mLAA-
-根据8.1所计算得到的吸光值之差；d——比色杯的厚度，d=1cm；
x—NADH在340nm处的摩尔吸光系数，x=6.30L·mmol-1cm-1通过式(A.2)可以计算得到湿基样品中总的乙酰基含量：Wab
式中：
-湿基样品中总的乙酰基的质量分数，%；-待测溶液中总的乙酰基的质量浓度，单位为克每升(g/L)；过滤前待测溶液的体积，V，一200mL；待测样品的质量（见7.1.1或7.1.2)，单位为克（g）。由此可以得到：
43X3.23X200X△A
1000×0.50x1X10×xXml
通过式（A4）可以计算得到干基样品的总的乙酰基含量：100
式中：
样品水分的质量分数，%。
EhttnFeoatone
消去异常数据后的实验室数目
有异常数据的实验室数目
可接受的实验结果
乙酰基平均含量/（%)（质量分数）重复性标准偏差s./（%)（质量分数）重复性变异系数/(%)
附录B
（资料性附录）
实验室间实验结果统计
GB/T20373--2006/ISO11213:1995表B.1实验室间实验结果统计
重复性限r=2.8×s,/（%）（质量分数）再现性标准偏差5R/（%）（质量分数）再现性变异系数/(%)
再现性限R(R=2.8XsSR）/(%)（质量分数）H：商含量：
L.低含量；
M：变性玉米淀粉；
P：变性马铃薯淀粉；
W，变性小麦淀粉。
GB/T20373—2006/IS011213：1995参考文献
[1]Bergmeyer,H.U.酶法分析方法（第二版）,1974，1：112-117.[2]
GB/T63791986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准方法的重复性和再现性版权专有侵权必究
书号：155066：1-28228
GB/T20373-2006
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