【国家标准(GB)】 转基因产品检测 核酸定性 PCR 检测方法

ICS 67. 050
中华人民共和国国家标准
GB/T19495.4—2004
转基因产品检测
核酸定性PCR检测方法
Detection of genetically modified organisms and dcrived products-Qualitative PCR methods based on nucleic acid2004-04-13发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局美型防伪
中国国家标准化管理委员会
2004-04-13实施
GB/T 19495.4—2004
规范性引用文件
术语和定义
随污染芦施
袖样和制栏
仪器设备
检测北骤
结界剃定
结至表述
测试支件
附录A《规范性附录）
物和特异生检测方法
附表B（现范性附录）
筛选检测方法
除录C（规范性附录）
结构基因特异性检测方法
附录D（规范性附录）品系特异性检测方法参考文献
17000S
请数800
国北国
GB/T19495转基固产品检测为系列标准：GB/T 19495. 1 2004
-GB/T 19495.220C4
GB/T19495.3—2004
GB/T 19495, 4—2004
GB/T 19295. 5—2004
GB/T 19495.62004
GB/T 19495. 7-2004
G3/119495.82004
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
通用要求和定义；
实验空技术要求；
核酸提取纯化方法；
核酸定性PCR检方法；
核酸定带 PCR检测方法：
基函芯片检测方法：
抽样和制栏方法；
蛋白质检测在法。
本部分附录A、附录B、附录 C.附录D为规范性附录。本部分出国家认证认监督管理委员会提出归口：GB/T 19495.4—2004
中华人民共和国上海出入境检验检疫局和中华人吴共和国天津出人境检验检局负责起草，国家质量监督检验检疫总局动位物检疫实验所、中华人民共和国广州出人境检验检疫局、中华人民共和国宁出人境检验检疫局、山华人民共和国江苏出人境检验检疫局、上海市农业科学院、吉林省农业科学院参加起草。
本郭分起草人：滑良文、郑文杰、沈禹飞、刘恒、张舒业、朱水芳、覃文，曹际娟、张大兵、祝长青、蒋原潘爱凭、张明。
本部分系首次发布的国家标准，A00S-DeTs
汉制标泰登
滋式小地水鲜院
老设房会家
奇式饲谷消宝新药
式费信用带能
出式联给灵白摄
高特国区夏
开名宝肥三行
国热国气印基
提然品气出基务
喝驾品气商有
房彩品高国高
南创教区
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健高，琴高信命限变学单出人通用决国国人老中飘交针售连人手骨养寿阳人中卫的科共育人车中，民会必的和人社睡一国康共房人理中，高健来安新款总习健保业益更员全鸡自特光全桥出南房社城办鑫庭鲜人出液工国国县京人心小豆健会大电市国能您
暴，青头，乳大燕，属丽道，文，费术来，亚神茶，吸真炎国文草，文病新人草国公请车国出兰善
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转基因产品检测
GB/T19495.4-—20C4
经痘河融内思校家恩面
核酸定性PCR检测方法
1范围
业活连军武美创美丽展
新勿真雅服无非
GB/T19495的本部分规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法。最费
本部分适用丁种子、饲料、食品相环境样品中转基因成分的定生PCR检测。含·国
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通GBT19495的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注1期的引用文件.其随后所有的修改单不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本部分，然间，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件其最新版本语月于本部分。
GB/T 10495.
GB/T 16495
GB/T 1949
GB/T 1943
GB/T 1549
3术语和定义
转基因产品检测
通用要求和定义
转基因产品检测实验室技术要求2004
20C4转因产品检测核酸提取纯化方法2004转基四产品检测核酸定量PCR检测方法2004转共因产品检测抽样利制样方法见CB/T19495.确立的术语和定义适用于本部分。4防污染措施
按照GB/T194952
5抽样和制样
-2004的规定执行。
按照GR/T194957
004规定的方法执行。
6原理
6. 1 一般原理
和数质鱼
可拉选带价
AAC乳
锦家童IS.8
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改国鲜衣具
特美养·科养豆#
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大于食AVO建期当
宗性分析色括对测试样品月称核酸序列的筛选检测和(或)特异性检测。在设置合适的对照和在检测下限的情况下定性检侧结果要清楚判断样品是香为转基因产品。本检测方法包括：可标序列的扩增和检测：扩增片段特异性的确证。6. 2 PCR 扩增
特婚果豆
目标字列的扩增是在反应缓冲液中,脱氧核精核较三磷酸、寡核苷酸引物在DNA聚合辐的作用下进行的律化反应。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂，DNVA扩增息一个循环的过程：一通过加然使双螺旋DNA变性成为单链核酸：在合透的湿度下引物和目标序列发生返火反应：大富
量一在合适的湿度下，结合在两条单链上的引物适过DNA聚合酶作用进行PCR延仲反应。6.3 PCR产物检测和确证
可以通过资胶电泳或其他方法检测PCR产物，必要时可以将PCR产物从胶中分高出来进行GB/T 19495.4-2004
检测。
可以通过限钊性内切酶酶切分析、杂交、DNA序死分析或熔点由线分析等方法对PCR产场送行确证。
兴用实时荧光PCR方法检测时，扩增及检测同时进行，赚数7试剂
7.1将PCR反应液分装放小包装，每次取部分进行反应测试，其余咨液保存在一20℃。7. 2模板 DNA/对照。
7.3水。
7. 4 dNTP溶液,含有 ATP,dCIP,dGTP,dTTP7.510×PCR缓冲落液。
7. 6耐热的 DNA聚合酶(Tag酶）。患面用受增准激本糖M7.7 正而引物。
反问引物。
仪器设备
见GB/T 19495.1--2004。
9检测步骤
9. 1 一般性要求
拿，楼限，计邮年销服价直车
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（全内
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测试群品中LNA的提取和含量测定应按照GB/T19495.3～2001中的规定执行。每个实验室样品应制备成2个测试样品提取DNA测试实验应设立PCR抑制剂对照，PCR抑制剂对照的设置见GB/T19495.1--2094对栏品进行 DNA 提取时要保证: DNA 的质量和浓度的稳定,以保证 PCR 反应的可重复性。要确保提取的DNA片段大于扩增片段。9.2PCR 要求和操作
9. 2. 1 操作准则
具体的检测方法见本标准的录A至附录D9. 2. 2 扩增反应的一般要求
反应条件.特别是离子浓度以及热循环条件要对每个引物和体系进行优化。对于特定的样品首次使用某，引物体系时，要证实所采用的循环条件不出现竞争性产物，以免降低PCR检测的敏感度。当模板DNA分子大于10个拷贝时：一个标准的PCR反应在4C个循不之内就能得到可检测的PCR产物。随着循环数的增而,非特异性PCR产物出增加。多-个优化的 PCR反应要确保能使 100 个拷贝的参照样品的月标模板DNA在0个PCR扩增循环内得到可检测的ICR严物，对于不同的物要严格控制其反应温度和(或)时间.同时也要严格控制不问仪器所采用的反应混合液。敏要到9.3PCR反应设计
9. 3. 1 一般要求
用于不同特异 PCR 反应结果之间要有可比性,并且在进行复合 PCR 和竞争 PCR 检测时,初个特异 PCR之间会相互发生作用，
9.3. 2扩增片段的大小
待拉增后杯片段大小的进择应与研究样品LNA的分了大小和匹配。如从加「食品白得到的变性DNA，扩增产物理想的范围为G0hP～~150hF；对于未经加「的品：扩增产物片段可以长一单，如：250左右。贝要适过预实验验证能得到大小不同的扩增片段仿引物是可行的，那么这些引物就可应2
用到样品的检测上。
9. 3.3引物
9. 3. 3. 1 —般要求
在对录中给出了引物完整的序列信息资料，9. 3. 3. 2 引物设计
引物计应该遵循以下要点：
每个引吻长度为18个~~30个该甘酸；退火温度大约为60%℃，熔解温度65℃；GB/T 19495.4-2004
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GC/AT的比跑为50：50，或辰可能接源这个比率：当引物较短时,应降低碱基中G和（的浓度（内部高稳定性）：3未端不存在百补性，从避免引物一聚体：内部没有二级结均：
没有与检测 PCR产物的探针结合成一聚体的可能：可以德用软件设计引物。
9. 3. 3. 3 引物的验证
93. 3. 3. 3. 1 一般要求
必须证实引物能够扩增其月标序列。弓物的验证分两步，首先是理论特异性，其次是实验特只性。9. 3. 3. 3. 2理论特异性
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闽评价至少应该在个+要的核酸序列数据库(如：FMIBI,GenBank)里进行序列同源性比对（如FastA，Blest），评价其他生物体足否与该引物H有同源序列。9. 3. 3. 3. 3实验特异性
在引物特异性的实验评价中，主要是确证弓物是否有能力区分目标基因和相近生物的基因序列及阴性对照。
9. 3. 3. 4 对照
PCR反应需设立至少包括一个阳生对照，一个阴性对照和一个空自试剂对照，对照的设置应符合GB/T 18495.1—2004 规定。
9. 4PCR检测方法的类型
对转基因产品的定性检测和确证，要根据待测食品的类型和分析要求采最不同的PCR试验。包括：
物种特异性检测方法：
筛选检测力法；
结构特异性检测方法；
品系特异性检测方法。
9. 5PCR 反应条件的设置
附录A至隔录D给出了各种检测方法的反应条件。9.6扩增产物的检测和确证
附录 A 至对录 D 给出了各种 PCR 产物检测的方法台
对筛选测试给果为阳性的样品，应对外源结构特异基因或品系特异基因进行进一步检测。当PCR检测结果为阳性时，还应通过下列的方法之一迹行确证：用特异DNA探针进行杂交：
PCR产物的限创性内切翁醇初分析；PCR产物序刻测定：
CB/T 19495.4—2C04
实时荧光PCR方法（采用GB/T19495.5-2004方法）；其他验证方法
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注：如其标片段安源于自然存在的蒲毒或微生物,应通过检测病毒或微生物战固组其他序列,从而判断样品转基因产品还是[转紫庆产品，颜如，CaMV3S启动子求白于花娜菜花计临毒，此转基固生物DNA和（战）花郁萎花叶病霉 DNA 中都有可能检测到, CaMV 35S 危动于如果没有检测到花帮英花叶病的其化序列,那之可试确定 CaMV 35S启动了是源自于转基因生物。10结果判定
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PCR检测时应做平行实验-两份平行测试样品的给果应该保一致：如果一个测试样品的结果为阳性而另一个为明性时,应重新进行检测。可通过增加 PCR反应中TDNA的模板量：两份平行测试样喆的结果致。
所检测月标马段出现增,且PCR产物经过确证,所有对照结果正常,结果判定为阳生:所检测目标片段未出现扩增，所有对照结果正常，结果判定为阴性。11结果表述
11. 1 一般要求
实验结果不能用“
阴性结果不能用“不
11. 2 阴性结果的表述
表述。
GMO\(\MOnotpresent\)来表述测试报告应该包折下列内容：
“对十×物种.木检测出转基因成分。根据×义义（即标学照物质），该方法的检测下限为×路。英文表述为：
\For species x GMp derived melteria! was not deteeted.格面
净#80
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The Lon of the metbod is X deterrrined with xX x (identify thc reterenge materiab.\11. 3阳性结果的表达
测试报告应该包
列内：
“对于义物,检测出转基医成分。”英文表述为：
\For species X,the pre
12测试报告
ceof GMOderivedm
按照GR/T19405.1-2004规定出具测试报告，erial was de
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A, 1 大豆物种特异性检测方法
4.1.1范围
附录Ａ
(规范性附录）
物种特异性检测方法
GB/T 19495.4—2004
本方法规定了大豆（Glyelinemaa）物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。术方法可用束评价从大京加工产品中提敢的 DNA的质量，并可判断是否有足量的 DNA用于转基因成分检测，
A.1.2原理
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追过 PCR 扩增和凝胶电泳分离可得到大小为 118 bp 的人豆 Leetin 基因片段。Ea
A. 1. 3检测下限
本方法能检测 0. 1 ng的大豆 DNAA. 1. 4 试剂
A, 1. 4. 1
般要求
按照GB/T19495.D2004的要求执行，度. 1. 4. 2 水。
A.1.4.310X×PCR缓冲液（不含氯化镁）。A. 1. 4. 4
A. 1. 4. 5
氯化镁溶液25mmol/L。
dNTP 溶液 2. 5 mmol/L
A, 1, 4. 6 引物
A. 1. 4. 6. 1 正向号
大豆Lectin基国（GeneBank编号：Koo821)S'GCCCTCTAOOICCACCCCCATCC3
A, 1, 4. 6. 2 反向引物
大豆1ectin基因（eneRank编号：K00821)5'-GCC CAT CTG
A. 1. 4. 7 Tag 酶:5 IU/A
A.1.5仪器
A. 1. 5. 1 PCR 仪
A. 1. 5.2 电泳仪。
A. 1.6 PCR 扩增
A. 1. 6. 1 PCR 反应体系
TTTTTGTG-
最雅巢城
武老小大鱼曲
自集吃
唐气#行
奥集租81
汽美饰
特林地康蛋S大
制型全
香员有学车兴出
本方法中，PCR反应的总体积为25L.反应体系见表A.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。
样品DNA
PCR反应体系
终浓度
10 ng50 g
10×PCR缓冲液（不含氧化镁）
加体积/L
GB/T 19495.4—2004
氯化镁溶液(25miml/L)
dNTP溶液(10 mmol/L)
正向引物(5 μmol/L)
反向引物(5 μtmol/L)
Ta4 酶表A.1续）
终浓废
1. 5 mmel/L
0. 8 mmol/L
0. 2 μmol/L
C.2 μel/L
加样体积/uL
往：如 PCR缓冲液中已经含有氯化镁,则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为 1. 5 mmcl/L.。A. 1. 6. 2 PCR 对照
使用具有源性的阳性标准物质作为阳性刘照。其的对照见GB/T 19495.1—2004，A, 1. 6. 3 PCR 反应参数
PCR反应参数见表 A.2。使用不同的 PCR议,可对参数作适当地调整。表 A. 2 PCR 反应参数
预变性
循环数
最终延伸
A. 1. 7确证
40 5.60℃
40,727
3min.72℃
10 min.95c
山食出
#巨维
TVAD刻进
如果结果具用米评价所提取的DNA的质量足否适用于PCR 扩增,则根据产生118 bp的 PCR产物的大小来判断。
如果除「述提到的的外，还有其他目的，则扩增产物的特异性可造过采用实时荧光PCR方法，或对扩增产物进行序列测定加以确证。A. 1. 8 结果表述
如果 PCR 产物通过电泳道过确证,可表述详品 DNA溶波中含有来源于大豆的可扩增的 DNA,A.2番茄物种特异性检测方法
A.2. 1范围
本方法规定了检测番药（LyeobersiconesculentumMill.）物种特性单拷贝DNA序列的常规程序，本方法可用来评价从著加工产品中提取的DNA 的质量,关可判断是否有足量的 DNA用于转基因成分检测：
A.2. 2 原理
道过 PCR 扩增和凝胶电泳分离可得到大小为 126 ba 的番茄 PG基因片段。A. 2. 3 检测下限
本方法能检测 (,1 ng的番茄 DNAA. 2. 4 试剂
A.2. 4. 1一般要求
按照GB/T19495，「—2004的费求执行A.2. 4.2 水。
阿赢新
A.2.4.310X×PCR缓浪液(不含氯化）GB/T 19495.4—2004
电主国蓝香量餐建人健意通讲来威风模景膜A,2.4. 4 氯化镁溶液,活 mmol/l.A. 2. 4. 5
5dNTP溶液,各 2. 5 mmol/L.
A.2.4.6 引物:
A,2. 4. 6. 1 正向引物
雅河来小大酷修
想动国
易动婴光的用
PG基因(GeneBark编号：Xo4583)5'-GGT CGA ATT CTT TAA ACT TGT TCT-3'A,2. 4. 6. 2 反向物
PG 基因(GeneRenk编号,X04583)5'-GCA AAG ATG CTC TGA AAA TTA GA 3'A. 2. 4.7 Taq 酶,5 IU/μL,
A.2. 5 仪器
A. 2. 5. 1 PCR 仪.
A.2. 5.2 电泳仪
A.2.6 PCR 扩增
A.2.6.1PCR反应体系
送来环盘83-
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本方法中，PCR反应的总体积为25uL..反应体系见表A.3。可以在不改变试剂液度的情况下，活当扩大发应体系。
样品DNA
10×PCR缓冲液（不含氯化镁）
化铁溶液（25mmol/1）
dNTP 溶液(IC umol/L)
正向引物(5 urnul/)
反向引物（5μmo/1.)
Tag陈（5IU/uL)
PCR应体系
终装度
10 zg.-30 ng
1. 5 mmal/L.
0.8nunol/L
5.2 nmoi/L
0. 2 umol/t.
样休积/ut.
注：如PCR缓计液中已经合有氯化馈，谢氯化认在反应混合液的终液变应调监为1, 5 mmo/A, 2. 6. 2 PCR 对照
使用具有溯源性的阻性标难物质作为阳性对照。其他的对照见GB/T19495.1-2004。A, 2. 6. 3 PCR反应参数
TYTTTAOT
PCR反应参数见表 A 4。使用不同的 PCR仪,可对参数作适当地调整。表 4. 4 PCR反应参数
顾变性
循环数
最终延神
20 8.95℃
40 3.60℃
40 3.72℃
10 min.95c
GB/T 19495.42004
A.2.7 确证
如累结果用求评价所提的 DNA 的质量是否适用于 PCR扩增,则根据产生 126 bp 的 PCR 产物的大小来判断。
如果还有除上面提到的目的之外,还有其他月的.则扩增产物的特异性可通过Southern杂交，或采片实时炭光PCR方法,或对扩增产物进行序列测定加以确证。A, 2. 8结果表述
如果PCR产物通过电泳道过确证,可表述样品 DNA溶液中含有来源于番茄的可扩增的 LNA，A.3玉米物种特异性检测方法-1
A.3.1范围
本方法规定了检测玉来(2ea-m23's)物种特异性单烤贝淀粉合成酶基因(2S.SIIb)序列的常规程序本方法可用来评价从蛋来加工产品中提取的 DNA 的质量,并可判断是暂有足量的 DNA月于转基因成分检测。
A.3.2原理
通过PCR扩增和漫胶电泳分离可得到大小为151bp的聚SSIIb基因片段A.3.3检测下限
本方法能检测Ong的下米DNA
A. 3. 4 试剂
A. 3. 4. 1
按照GB/
A. 3. 4. 2
19495.1.2C04的要求执行
A. 3. 4. 3
PCR冲液（不含氣化镁）
A, 3. 4. 4
A.3. 4. 5 dNTH
A.3. 4.6 引物:
25 mmol/L
没各2.5nmmol/L
A. 3. 4. 6. 1 正向引物
zSSJIb基因(GeneBaak编号：AFc19297)5'-CEC CCA ATC TT
4. 3. 4. 6. 2 反间引物
GA CAT CTG C-3\
sSsHb基因（GeneBank编号，AFo19297)5 -TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3'A. 3. 4. 7Tug 酶:5 IU/μL.
A. 3. 5仪器
A. 3,5. 1 PCR 义.
A, 3. 5. 2 电泳议.
A, 3.6 PCR扩增
A, 3, 6. 1 PCR 反应体系
新信讯
高重真
国博国
温电兰北
本方法中，PCR反应的总体积为25uL,反应体系表A.5。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。
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