【国家标准(GB)】 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

规范性引用文件
实验室通用要求
提取步骤
视试报告
录A（舰性录）
附录 (规范性附录)
附录C（规范性翁炙）
附录D（规范性附录）
附录E (规范性附录)
附录F（资格性附录）
参考文献
酚-二氯巾烷法提攻DNA
PVP法提取DVA
CTAB法提取 DNA
硅土法提取 DNA
胍 三氢甲烷法提取 DNA
提取DNA方法应用实例
GB/T 19495. 3—2004
CB/T1549.《转基因;-品检测》为系列标准：CB/* 19495. 1—3004
GB/- 19495.2-
—20G4
GB/ 19495. 3-
GB/T 19495. 4
GB/T 1S495.5-2004
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品捡测
转基因品检测
转基医产品检测
GB/T 13495.6 2004
转基医产品检测
GB/T1S495.72004转基匹产品检测GB/T194S5.8—2C04转基齿产品检测言
通用要栏定义;
实验室技术要求；
核酸提敢纯化方法：
核酸定唑PCR检测方法：
核酸定量PCR检测方法；
其西芯片检测方法；
抽栏和制祥方法：
蛋质检测方法。
本部分引用了ENISO/DIS21571中的部分内容。GB/T 19495. 3—2004
本部分的对录A、对录 B,附录 C、附录 D和附录E为规范性附录,附录:F瓷料附录本望分出巨家认证认可监督管理委员会提出并归厂木分出中华人民共和国质量监督检验检疫总员批准发布。木野分起草单位：宁华人民关和匡止东出人境检验疫局，中华人天共和国汕头出人境检验检疫局、中华人民共和国广州出人境检验检疫局、国家质量监督捡验检接总局动殖物检疫实验所、中国农科院生物技术所、山东农科统植保所，本部分士惠起壹人：高宏伟、相大鸥、覃文、未水芳、东长法、蔡颖、许业莉、庄逸林、梁希场、甄字江、金茅军、路兴液
太部分系首次发布的国家称翟。1范围
核酸提取纯化方法
转基因产品检测
GB/T19495.3—2904
G/T19495的本部分规定了转基因产品中DNA提取纯化方法以及DNA溶液浓度测定的基本要求。
本部分用于转基因食品等加工产品，包适用丁转基因农产品。2规范性引用文件
下列文件中的条款道过GB/719495的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注H期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的备方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用一本部分。
GB/T 19495. 1
GB/F 19495. 2-
GB/T 19-95.5
GB/T 19495. 7
3原则
一般性原则
基因产晶检测
通用要求和定义
实验室技术要求
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
核定量PCR检测方法
抽祥和制样方法
核酸提取的目虚提供合适的用于后续分析的DNA，DNA的质量包指提取的DNA分子的平均长度，化学纯度以及DNA序列及双螺旋的完壁性，例如，DNA碱基的链内、链问的联系，单链问隙约联系等。而且，这些情记是序列特异性的，因此在基固组中不是随机分布的。3.2提取
DNA提取的基本原则是释放样品中的DNA.随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂，附录A中不司的DNA提政纯化力法道用于不同的样品，LDNA定量有助于店的PCR分析，可以通过物理方法（测量特定波长下的光吸收）.化学物理方祛(结合可以发荧光书物质）
含量候或已降解的DNA。
4实验室通用要求
法(生物荧光检测)或者定量PCR方法后着最适用于多组分样品以及随机的DNA污染米源于灰尘及气溶胶。因此，实验室工作区域的组织以及良好的实验操作(GLP)基T:
实验操作中每一步骤拍系统控制：祥品操作的“单问流动\原则。后者可以保证被分析的DNA以及ICR产生的DNA保持分离性，其体要求应符会GB/T 19495.2—2904中约规定5提取步骤
5. 1测试样品的准备
一般性要求
除了处于食物和（或)饲料起始端的农产品和粗加工材彩（如粉碎的产品），大多数工业加工花食GB/T 19495.3—2004
品经避了物理、化学及醇的处理。这些处理会降低DNA的含量及续度，因比，孕一方法的适用性及重复性会随特异样品而异，碎特定的TNA提取方法的性质特征么藏子被研究的食另种奖。实验室样品的代表坐应符合CB/T15495.7-2004本部分附录A至附录F的方法中，测试样品为250mz（20Cmg~300mg）对于DNA半富的原材料（如子)是足够的，但对于DNA含量保或有降解的材而言是不够的。这种情况下，测试伴品量可增加至：~g，髓出这二限的测试样品不在本部分的桓架范围内每个实验室栏品应分别从两份测试栏品中提取LNA，标椎品、实验室样品及视试样品的保存应按照GL/T19495.1-200/的规定执行。5.1.2祥品
实验室样品应充分均--再制备为测试荐品。所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2一2004的规定执行，小心操作确保防任何的污染样品组分的改变.
液体含量高的固体或糊状样品不易被研磨成理想大小物题粒，间以逛过研窘过程中去除液休，研磨前冷冻改冷冻干燥等方法处理。对于膏状或粘性样品的研磨，可以采取下列的措之一用来处理：加热（不超送40）：
一置干液体中均质(姑置于水中)：—冷法（线—20℃）
上述方法处理后哟实验室品可能有稀释或滚缩，应混匀后制备份测试样品：对于液体样品，摔晃卒器以便产品更与质化，对于诸如原油一类的无法均质化的样品，应确保所有的沉淀已经完全从穿器药内率脱离。
对丁不易悬浮的士体样品,应该进行研罹以利于DNVA提取，在这种情洗下，应该注意到颗粒的大小。月来进行提取DNA的测试样品应包含GB/T19435.7一2004所规定的最少量的颗粒，任何可能产生灰尘的步应与其他分析步骤分离开束，根据陆录中的方法，所有可清除的盐、调味品、粉状糖部应该被考虑纠。
对于多纽分样品月标样品（比如鱼排中的面包层)可以被分离用来进行DNA提取。所使用的方法程序在分析报告中应进行猎述，5.2DNA提取与纯化
5.2.1一般性要求
为了获得质查哟DNA，宜去除的杂质及采用的方法：用合适的酶（果胶酶、纤维酶、半纤维酶、淀粉酶等）处理去除多糖类物质（集校、纤维、半纤维、淀粉、增稠剂）或者用有机试剂提取（如CTAB/二氯甲烷）：用合适的处理方法，比如RNA酶和蛋酶分别处理RNA和（或)者当白质；少量的渡体残留可采用酶处理或者有机试剂处理（如正已烷）；可能对下游的分析产生十扰的垫（来自提取液、组孢分裂缓液和DVA沉淀等步骤）对于固体或者下操的样品，细胞分裂级冲液或抽提缓户滚的体应足以保证LNA.的溶解DNA翁绝化可以道过酚、三裁平烷、乙醇、异丙等等少量溶剂来沉淀，或吸附在国体材无上（羽离了交换树脂，叠藻土或玻璃胶，膜等）。几种DNA纯化的方法可以结个送行。妇果合理搭配的活，DNA的提取利纯化可以在司样的步骤户进行，为了提高T)NA的回收率，而在沉淀步骤中德用共淀剂（如糖愿.PEG或t-RNA)，这种共沉旋剂不应含任何核酸酶污性或者PCR批制剂和(或)竟争剂-也不应包含任何可能在研究剂检测中与月标序列 DNA相奖似的字列
真空冷冻干燥 DNA时,应避免交及污染。LDNA宜重唇在水或缓冲波中以防上DNA降解。5.2. 2提取空自对照
GB/T 19495. 3—2304
为了检查在提取运程中可能存在的污染应设置提取对照（提取空气对照），提取空户对照宜,刊缓冲液或者水代替栏品，理惩清说下提斑空白对照村可以片为试剂对照。提取空与对照的试管应置于每人提取系列中的最后·个。
划人异源核设惑老核酸担体（如：糖原,PG)作为共抗凝剂，可能在改著提瞰过程仿污染有帮助。共沉剂可以是不相关的DNA（如：些鱼或青鱼精子DNA），也可以是非转基医原材料或粗加工品DNA，非转基因产品测试样品司寸取时还可作为转基因产品检测的阴性时照，当使再核酸担碎时应注意加,人到 PCR 反应体系中的总 LNA 模板量,超量将抑制 PCR 反应。5.2.3提取回收率对照
在建）一种新的DNA提取方法吁，鼓者在使用队录中的方法提取一种未曾使用该方法是取过的详品DNA时，应划该方法的提取效率进行评估：如人一定已知含量的示踪DVA(traCc：DVA)到测试样品中，并且设立一个不加示踪DNA的对照浏试栏品，对这两个栏品同时提取DNA。根据示踪DNA的提得率，判断该方法提取该样品的TNA得率。设之提取回收率对照可用于判断测试样品中是否含有可提取的DNA或是否含有PCR抑制剂，5.2.4DNA提取液PCR抑制物的判断在建立一种新的 DNA 提取方法时应对所提取的 DNA溶液中是否合有 PCR 抑剖剂进行判断，加人接近 PCR检测下限含量或超过检测下限数倍含量的目标核龄到 DNA担段液中,然后进行 PCR测试。如果 DNA 提取液和如人了目标核酸的 DNA 缇取液均未出溺扩增,而单独检测目标核酸时能出现扩增，则说明 DNA 提液存在 PCR拍制物。5.3DNA定量
5.3.1一般性要求
ENA定量可以：
比较不间提取方法对同一样品的DVA提取效率；在PCR反应尚校准DNA的量；
监测司一样品不同比次的DNA浓疫的变化。5. 3. 2 DNA定量方法
5.3.2.：紫外光谱法
5.3.2.i.1范围
紫外光谱法为溶液中DNA滋度定量的常却方法。5.3. 2.1.2原理
溶液中的核酸可以吸收2151um~500nri的紫外线(UV),并[在26c nm这到吸收高峰。因为T)VA、RNA在2601Tn都有它们的吸女高峰，因此，核骏溶液十RNA和单核并酸污染物无法用 UV光谱进行辨别。
5. 3. 2. 1. 3应用注围
本方法可以用米定量从2g/ml.50g/mL的DNA含量。在定量之前，为了与光逆仪（光密度从0.C5-~1)的曲线保持一致，成该对等要定量的DNA溶液进行适当的释。注：循然况，疑阐为成分（上刻来自于CTAR法LDNA的接取过程)可能会T优JV在260 nm的择制,齿方CTAB在这个波长也激吸收
5.3.2.2琼脂电泳法
5.3.2.2.1范围
境脂糖屯液法为尼济液中DNA液度定量的常规方法。琼脂糖屯泳法分析物埋影响因素，如DNA降解程度、RVA残留的存在和~些污染物3
GB/T 9495.3-2004
琼脂糖电泳法适用于在 DNA 内浓度不足以进行光谱定量、或 LNA的纯度不高、或混有某些吸改紫外线药杂质的 LDNA溶液浓度的测定DNA降解的情况下.不推荐使用凝胶电泳药力法迹行 DNA定量，5.3.2.2.2原理
恶DNA处于分子筛中（比如琼脂糖）在缓冲液存在的情况下：处三电场中，根据DYA本身所携的电荷利分子量，可以被口就分离。溴化乙锭可以镶嵌到DNA分了中，当受到紫外线激发时，敢发出橘黄色的荧光。口丁溴化乙锭也可镶嵌到单链 DNA和 RNA分了中，对于更精确 DNA定量，需要而葬云除 RNA,白丁荧光的亮度与总IDNA量成正比,因此，振据荧光强度，与已知含量的不同浓度的标准DVA进行对比可获得样品 DNA 溶液的浓度。标准 DNA的分子量应该和待测DNA的分子量相近,因为漠化乙锭的镶嵌,荧光的散发和 DNA片段的长度相关。
5.3.2.2.3应用范围
不，本方法可以对浓度从5 ng~5c0 gDNA进行定量，在停用光学投像系统的条
5.3.2.3实时荧光POR法来对提取的DNA进行定量的方法当提收DNA含量少的释品时，由于方法灵敏度的素·上述方法都不可以边行DNA定量，只能来用实讨荧光PCR法具体内容见本系列标准GB/119495.520045.4提取DNA的稳定性
提取的DNA应保高好，以保证其在后续分析中的稳定性，避免反复冻融6测试报告
每次提取DN4续验的测试报告应包含GB/T1949%样品来源
咨户要典
采样日期及果样方式（若知道）；收样日期
DVA提取前实验室样品的初步处理用于提取的测试样品的大小，
DNA提取
程序；
测试中的任何异票
一2004中规定的内容，还应包括：方法中末提到或可选择但可能对结果有影响的操作；原始实验纪录：
实验室口忘：
分光光度计或其他DVA定量方法的纪录具体的PCR方法和DNA提取对照；胶片的负片：
给果的解释；
实验者姓名，
酚 三氨甲烷 1 法
A,1.范围
附录A
（规范性附录）
酚-三氯甲烷法提取 DNA
本方法适用于从多类样品中提取DNA，适用范围广。GB/T 19495.3—2004
当分析富含多元醇，叶片或者绿色物质时（出如菊首叶片，干燥的首稽等），很多PCR抑制剂会和LD)NA共沉淀。由此可能在获得 PCR 扩增产物时会巡到困难。考虑到酚可能产生的魔纯作扇，应建之CTAB和（或)PVP和(或）硅藻王吸附等方法。A.1.2原理
本方法由裂解（在高沙度EDTA和SDS的情况下进行热裂解）、酚三氯甲烷去除杂质（如脂类分于，多糖和蛋白质）以及包含DNA水相中的核酸酶，最终用乙醇沉淀DNA新除去故及残留的三氯甲烷儿个步骤组成。
A. 1. 3 试剂
关键步骤是裂解。
A. 1.3. 1 36%Z醇(Q.H.OH),
A. 1. 3. 3
A. 1.3. 4
4. 1. 3. 5
冰乙酸
乙酸铜
20℃保存及应用。
37%盖酸lICD)。
异戊（CH.）,CHCH.CH.OH
酚（CH,)
A. 1. 3. 6
A. 1. 3. 7
三氯甲烷nCHCI）。
Tris(hydroknethyb)-aminonethane,TRIscc,H.NO.)A. 1. 3. 8
A. 1. 3. 9
乙二胺四〇醉
A, 1. 3. 10
A. 1.3. 11
A. 1. 3. 12
A, 1. 3. 13
A. 1. 3. 14
A. 1. 3. 15
A. 1. 3. 16
A. 1. 3. *7
A. 1. 3. 18
氢氧化锌
二钾盐K.EDTA（CI4N.ONaa）。
氯化钾（RO
十二烷基磺酸SpS(CH2sO,SN)。
驾白酶K,冷冻干燥杂件下约 20 IU/mg。RNA酶，无DNA醇，来白牛瘦腺，冷冻干燥条件下50IU/饱和酚。
三然甲烷：异戊醇.24：1
酚：三氯甲烷：异戊醇,25：24：1。抽提/裂解缓冲液(pH8.0),TRIS0.C50noL/1.,K,EDTA0.05)mol/1.,SDS 30 g/L,使用HCI或 KOFI 调节 pH
A. 1. 3. 19
芍 pH。
TE 缓油液(pH8. 0),-RIS 0. C10 no/L,K,EDTA 0.001 mal/1.,使用 HC! 或 KOH 调爱白酶K溶滋.蛋1酶K29mg/mL、无菌水溶解，不要灭菌20℃保存，避免没复冻融。A. 1.3. 20
RNAse-A浒液，10mng/mL.-20C保存，避免反复流融。A. 1. 3. 21
7℃%乙醇溶液（CH;0H)，一20℃保存。A. 1. 3. 22
GB/T19495.3--2004
A.1.3.237.酸钾溶液，3Trio1/L，供用2.醋酸调节pH值到5.2、不要火菌(0.22μm膜过滤）。A.1.4主要仪器没备
A. 1. 4. 1
离心机。
水浴锅（60℃70℃工作范压）。A. 1.4. 2
A. 1. 4. 3
A. 1. 4. 4
真空干燥蝶机
冷冻干燥：
A. 1. 4. 5
涡施析。
A.1.5提取步骤
称取0.25：g粉碎、磨碎或液体材料至离心管中。a)
品入1.6ml.油提缓冲液，50L蛋白酶K溶液，ct至70C温育30min至2h（可过夜）加入RNA酶至终浓度0.！ug/ml。5000g离心30im:in，吸取上清液至另一离心管中。加人等体积的饱和前，混约，5000多离心15 min，吸取上层水相至另一新离心管中加人等体积酚：三氯甲烷：异戊醇至上被十，混匀，50c0g离心15min吸取上层水相至另一新离心管中，重复该亲骤1次~?次，直中间相清点。加人等体积三氯甲烷：异戊醇至上清液中，50c0名离心10in吸取上层水相至另一新离心管中，重复该步骤1次～2次，直至中间租清衰。g）斯人C.1×体积的乙酸钟溶液及2.5×体积的96%乙醇，轻轻颠倒混匀，液氮中放置，min，或--89℃放置15.或20℃过夜。
10000起（或13900g）℃离心至少15mim弃上清液，月2×体积的70%乙醇小心洗涤沉h)
淀，19 000g（或130c0g）4℃离心15min,小心倒上清，干燥沉淀i）用1COuL水或TE缓冲液溶解沉淀，得DNA储存液，注：根长伴品量调整缓冲液的体积。A.2酚-三氨甲烷 2法
A.2、1范围
本方法活适用于从香十提取总DNA，包括细菌基匹销DNA：从发醇香汤及热发醉香肠中提取的DNA,可用宁 PCR法检测重组 DNA。本方法适用于从乳路样品中分离总DNA以特异控雄测金黄色葡宝球苗（Stuphylocorcusaurrus）。本方法在采样量0.4e的情况下在实验室之间证明有效，A.2.2原理
本方法包括从匀浆的香肠样品中回收细菌细跑，随后经过离心，沉淀物不仅包含细菌而且包含肉题粒。溶菊醛降解继胞璧可特异裂解组菌，肉乳杆菌细胞壁的裂解，可加人变溶菌素。SDS及蛋白酶K可完全的裂解细胞，随后用酚-三氯甲烷-异戊醇儿次抽提水棺。酚-三氯甲烷有利于去除核酸酶及PCR反应抑制剂。最后用乙醇沉淀DNA。A.2.3安全防护
在处环有机成剂时采用通风握。4.2. 4试剂
4.2. 4. 1
异丙醇『CH,CH(OH)CHI
A. 2. 4. 2
96%乙醇（C15O1)，-23保存及使用，A, 2. 4. 3
冰乙酸（CH,COO）)
A,2.4.4 37%盐酸(HC!)。
A.2.4.5氢氧化钠（NaOH）
A. 2. 4. 6 异戊醇L(CH 2,CHCIH, CHOH1.A. 2. 4. 7
(CH,O)
三氯国烷(CHCla)。
A. 2. 4. 8
A.2. 4. 9
Tris(hyd:oxyncthyl)-aminoncthare,TRIS(C,IIn.N,)乙二胺四乙酸二钠盐(Na,EDTA）A. 2. 4. 10
A. 2. 4. 11
A. 2. 4. 12
4. 2. 4. 13
A. 2. 4. 14
A. 2. 4. 15
A. 2、 4. 16
A. 2. 4. 17
A. 2. 4. 18
A. 2. 4. 19
十二烷基磺酸钠SDS（CiHO,SNa）溶菌酶，50000IU/1ng黄白质。
蔗糖(CO
蛋白酶K，冷冻干燥条件下20IU/ngZ酸钠(NaC.II.O.)
饱和酚。
三氯甲烧：异戊醇，22：1。
酶-三氯下烷-异醇、25：24：1
GB/T 19495. 3—2004
变溶菌素溶液，:00 TU/1-1..或5000 TU/:nL.变溶菌素：无唑水溶解，不要灭菌：一20℃保存，避免反复冻融，
A. 2. 4. 21
A. 2. 4. 22
溶菌酶溶液，10 mg/ml.,使用无菌水溶解,不要灭菌，一20℃.保存，避免反复冻熟。蔗糖溶液（C:H201）.400g/L
缓冲液 A(pH 8.0),TRIS 0.020 mo1/L,Na,EDIA 0. 020 n./L.N=C1 0. 1 mel/L.用ICI 或 NeCH调 pH 至 S. 0.
A. 2. 4. 23
A. 2. 4. 26
A.2. 4.27
油提/裂解缓液，×积缓冲液A和1×体积的燕溶液。SDS溶液，250g/L.
蛋白酶K.溶液，20Ig/nL，使用无菌水溶解，不要灭菌，保存在：20℃，避免反复冻能。70%乙醇溶液（℃H,OH)：20℃保存及使月乙酸钠溶液(NaC.H,O,).3mol/L,用乙酷酸调pH至5. 2、TE缓冲液.Tris0.010mni/LNaaEDTA3.00Tmo1/L,用HC或NaOH调pH至8.A.2.5主要仪器及设备
A, 2. 5. 1
A. 2. 5. 2
A, 2. 5. 4
A.2. 5. 5
粉碎机。
离心机(12 c00 g)。
尽浴锅或温育器。
真空干燥琴（可选），
涡旋机。
提取步骤
切\200mg~500mg肉照，加入到3×你积的水中（至1.5mL)，室温效置10nina?
b）小心转移50cμL上清液至反应管中，2C0)g离心10nin.闺掉1:清液加人000ul.抽提缓油液悬浮浓液-并人500溶菌酶溶液。老仅加溶莲酶效果不好，可加人10 IC变溶菌素(须敏预实验),37℃湿育ih。d)
加入251.SDS溶液及2:μL蛋白酶K溶液，60℃温育-5min。灿人等体积酚-三氯中烷-导艾醇，混勾2min，12000&离心3uir，转格水相书万一新管牛。灿人等体积三氯手烧录戊醇，混勾2mir，_2 c00 g离心3 m:n，转移水至另一新管户。加入0.1×积的乙酸落液及1×体积的是两醇。颈倒儿次滤匀，室溢效置至少30mia.12000g离心5min，弃上滑液
用2×体积的70%乙醇小心洗涤沉淀，二2c00g离心13mir，小心到掉三清。倒掉上清液，干h)
燥沉淀。
用(OCμl,水或者 -E缓冲液溶解江淀,得到 DNA催在液。注：根据弹品量调整缓冲液的体积。7
GB/T 19495.3—2004
A.3酚-三氯日烷-3法
A.3.1范围
本力法追用一酸奶DNA的提取，追用于原酸奶及合各种水果、食品漆证剂稳定剂及不同含脂肪的酸奶，也适用于热处理短的酸奶。4.3.2原理
太方法适用于特碳种类的食吻样品。在破生条伴下溶解凝固的酪蛋白（coagrlateciaseir）后收集车兰天阳生菌的培养物、纽孢悬浮在水相中,用溶菌酶(或变溶菌素)降解细胞壁。细范裂解依靠去污剂SDS，蛋白酶K么除蛋凸质，随后用酚-三氯伴烷-异戊醇抽提最后用乙醇沉淀DNA。A.3.3安全防沪
仁处理有机试剂时采用逛风框
A.3.4试剂
A.3. 4. 1异丙醇[CH,CHKOOH,]
A.3.4.296%乙醇（CH0免费标准bzxz.net
乙醋酸(CH/CO)
4. 3. 4. 4
氯化钠(Nad
20℃的条件下使用保存
柠檬酸钠Na.O，）
A. 3. 4. 5
A. 3. 4. 7
4. 3. 4. 8
37盐酸（HCD)
氢氧化COH）：
异戊醇O,CHCH,CHOH
三氯甲院口HCL）
A. 3.4.10
A. 3. 4. 11
A. 3. 4. 12
A. 3. 4. 13
A. 3. 4. 14
A. 3. 4. 15
A. 3. 4. 16
A. 3. 2、 17
A. 3. 4. 18
A. 3. 2. 19
TrisCha
ymethyl)-arminomettaneTRIS,(CH.NO.)乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）二烷基酸钠SDS(CO.SNa)
溶菌酶，
蔗糖(C:
蛋白酶K，
乙酸钠(Vac
IU/mg蛋白质
mg，冷冻下燥状柔
行檬酸钠溶液
Na.O.).400 g/L.
氢氧化钠溶液SSC溶液（20XSSC),使用前稀释。A. 3. 4. 21
A. 3. 4. 22
A.3. 4. 23
A. 3. 4. 24
三氯甲烷：异戊醇，24：1
酸：三氯早烷：异戊醇，25：2411。变溶菌素溶液500IU/zml.或5000IU/mL变溶菌紊，无菌水溶解，不用灭髓，1℃保存,避免反复冻融。
4.3.4.25溶菌酶溶液，10mg/mL溶菌，无菌水溶解，不用灭菌：一20℃保存，避免反复涂融。熊糖溶液（C.1HOm），400g/L。A. 3. 4. 26
A.3.4.27缓冲液A(pHS.0),TRIS 0.020 mal/L,Na2EDTA 0.020 mol/1.,NaCI0.100 mol/!.,用HCI或Ne.OH调节pH值
A.3.4.28提取/聚解液，×休积的缓油没A和1%体积的蔗糖潜液。5
A. 3. 4. 29
A.3. 4. 30
A. 3. 4. 31
A. 3. 4. 32
A.3. 4. 33
PH值。
SDS 溶液,250g/L..
GB/T 19495.3—2004
蛋口酶K溶液，20mg/mL浓皮，无菌水溶疑.不用灭菊，一20℃保存：避免反复冻融。70%乙醇溶液(C,H,0H)—20℃使用和保存乙钠溶液(NaC,H.O,).3m0./L,用乙酸调- pI值到5.2TE缓冲液(μH 8, C),TRIS 0. 0.0 :no1/L,N=,EDTA 0. 001 rol/L,用 1ICI 或 NaOH 调A.3.5主要仪器和设备
A. 3. 5. 1
离心机12090g）。
水浴锅或加热装置。
真空干燥机
A.3.5.4 涡旋机。
A.3.6提取步骤
充分摇勾酸奶，取250酸奶到2mL的反应小管中，加人80μ柠檬酸钠溶液，加人氢氧化钠溶液井且限
X2000g离心2min
h）丢弃上层的脂防和水相重新以500ul.SsO溶液悬浮沉淀，12000g离心至少2min，丢产清液。重新用/50gL5×sSC.溶液溶解沉施。12000g离心至少2min，丢弃上清液。月500μ是取缓冲液悬浮沉淀，加人50μ溶菌酶溶液。若仅加溶菌酶效果不好，可加10IU变格菌素（须做预实验）。d）37℃温，加人25μLSDS溶液和25蛋白醇溶液，60℃温育10in，加人500uL酸三氛用焙异戊醇溶液，混匀2min，12000g离心3min将上清液转移到一个新肉反应小营，加入W体积三氮目烧：异戊醇溶液，混合2mim，12000g离心3min上层水和稳到新的反应小管中。加人0.1&体积的乙酸钠溶液和1×体积的异内醇，室温一e
放置300，12000g离心15min，弃上清液。用至少500叫乙醇液小心洗涤沉淀，12000g离心10min，天弃上清液，干燥沉淀。\）用1CO水或者TE缓冲液溶解，得到IDNA循存液。注；夜后样品量调悠爱他液的体积，A.4粉-三点甲烷4法
A.1.1范围
云方法适用于一步法从康丝状真菌或分离的谨落中提取PCR级的DXA。本方法适用于放分复杂的栏品中的转求医微生物！4. 4. 2安全防护
RNA提取，心其适用于对裂解不敏感的真菌或革兰氏阴性菌。在处理有机试剂采用通风橱
A.4.3试剂
4.4.3.196%乙醇（CHOH)，在一20℃使用和保存。A. 4. 3. 2
A. 4. 3. 4
A. 4. 3. 5
A. 4. 3. 6
A. 4. 3.8
冰Z酸(CH.COO)
硫酸 (50),≥90 %
碳酸氢钳(KHCO)
乙酸铂(KC H,O)
37%盐酸（HCI）
早成学[CH，)CHCH.CH.OHI
酚(CHO)
三氯丰烷(CHCIa)
GB/T i9495.3—2004
A, 4. 3. 10
T'ris(hydruxymethyl) aminorethsne TRis(C, IlutNO,).A. 4. 3. 11
A. 4. 3. 13
A. 4.3. 4
A. 4. 3. 15
A. 4. 3. 16
Z二胺回Z酸—師盐 ,EDTA(C:IN,O.Na.)。氢氧化钾（KOH)。
-二烷基磺酸钠 SDS(C: HasO,SNa),RNA髓,不含LNA酶·求白丁小牛姨腺。人约 5 IU/rng冷冻干燥状态下。饱和酚。
三氢丰烷异戊醇,24：1。
酚·三氯甲烧·异戊醇,2524：1，A. 4. 3. 17
A. 4. 3. 18
提取/双能缓净液（pH8.0).TRIS0.050riol/L.K，EDTA0.0:0)mol/!SDS30g/1.HCI 或KOH调节pH值。
TE缓冲液(1! 8. C),TRIS 0. 010 rnol/L,KELIA 0. 001 rrol/L.用 HCI或 KOH 调节 pH信A. 4. 3. 19
A. 4. 3.20RNA 酶溶液,RNAse-A IC mg/mL,冷冻干燥状态下。20 C保存！70%乙醇溶液（CI0H)，一2C保存使用。A. 4.3.21
A. 4. 3. 22
A. 4. 3. 23
乙酸钳溶液(KC.H,O,),3znol/L,用冰乙腰调节pH值到5.2.不用灭菌(0.22 μr1膜过滤)。坡离珠，将直经为c.2mm~-0.5mm的叛离殊放到浓硫酸中过，然店用衣需水洗涤，在碳酸氢钾溶浚中煮沸,用灭商水洗涤，然后在真空十燥器门80℃十燥。A.4.3.24碳酸氢钾溶凌(KHCO,),508/T.。A.4. 4
主要仪器和设备
A. 4. 4. 1 珠子打齿器，以 50次/ min 的敲打速度对2 \:L 操纹L的聚之烯管进行打击,A,4.4.2离心管,2mL螺纹口桑乙烯试管，A.4.4.3过滤装置,25r1m直径技璃纤维膜A.4.4.4离心机，配备2m=离心管的转子。A.4. 4.5
水溶锅或加热装置。
A. 4. 4.6
真空T藻器。
4.4.4.7满旋器。
A.4.5提取步骤
A.4.5.1测试样品制备和样品中微生物菌落的准备DNA提取前需分离微生物，有时微生物的分离要经过琼脂或体培养基增菌。妆获微生物后，可直接进行DVA的提取或一20℃冷冻保存直到送下一步处理。A, 4. 5.2 DNA 提取
a）用玻璃纤维滤器收集真菌，用不含STS的裂解液洗涤两次，将菌丝洗下并转移个2nl.螺纹帽的密心管巾，内装处刘的玻辖珠，600uL裂船液.600uL盼-三氯手螃-异戊醇，对于微尘物菌群，细菌.真菌.酵母或酵母样微生物，用不含SDS的，m裂解液洗涤：次.然b)
后1000～13000离心13min，至少重复一次。然后用600μL裂解液悬浮。转移至含有玻璃蛛及酸·三氯干烷-另戊醇的离心管穴。a)b)后，以100次/min的速率在珠子习击器上震荡1min～2tnin离心管，立即在65℃温浴c
3℃ mir120 min。10000g～13000离心-0min，转移上消液到新管中，（对于定管PCR可温溶30min后，10000g～13000离心15min，转移上清至普通离心管中，射人RNA酶，至终浓度为0.0c1tmg/mL.65℃温浴30min~90min）。人乙酸钾至终液度为0.3mol/L混与，人1.2ml.7醇。=20℃夜或—80℃保存h。4℃条件下10000g~~13000g离心15nr用之醇溶液小心洗涤DNA沉淀，十爆。用50T..100水溶解DNA。如桌一20℃长期保存（E年以1)，用TE代替水。1c
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