【国家标准(GB)】 转基因产品检测 核酸定量 PCR 检测方法

ICS67.G53
中华人民共和国国家标准
GB/T19495.5—2004
转基因产品检测
核酸定量PCR检测方法
Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative PCR methods based on nucleic acid2004-04-13发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-04-13实施
GB/T 19495.5-2004
彩家团闲味次人外中
2规范性引用文件
3术诺、定义栏缩语
防沔染措施
主要仪器设备
结果分析与计算
[0结秉表述
测试报告
录A（规范性录）
转基因大豆GTS-40-3-2实时灾光PCR检测方法转基因玉米MON810实时荧光PCR检测方法录B（规范性附录）
除录C (规范性附录)
附录）)(规范性附录）
陆录E（规范性除录)
转基因玉米B1176实时炭光PCR检测方法转基因玉米 B1:1 实时荧光 PCR检测方转本因玉来 GA21 实时荧光 PCR 检测方法附录F（规范生附录）转基因玉米T25实时荧光 PCR检测方法除录G(规范性附录）
参考文狱
转基因泊莱 R-73 实时荧光 PCR检测.方法歌震
GR/T19495《转因产品检测》为系列标准：GB/T 1$495.1—2004
GB/T :9495.2—2004
G3/T 19495.3—2004
—GB/T 19495.4—2004
GB/T 19485.5- 2004
-GB/T 19495.E—2904
转基质产品检测
转基固产品检测
转湛医产品检测
转基因产品检测
转基医产品检测
转基岗产品检测
转基因,产品检测
-GB/T 9495.7—2004
逐用要求和定义；
实验室技术要求：
核酸提取纯化方法；
核酸定性PCR检测I方法：
核酸定量PCR检测方法；
基因芯片检测法：
抽群和制样方法；
GB/T 19495.5—2002
转基因产品检盈白质检测方汰。GB/T 19195.8—2904
本新分的录A,对录B、附录C、附录D、附录E、附录三和附G为规范性附录，本部分山国家认证认可监督委员会提出并H口。木部分出中华人民其利国广东出人境检验检疫局和国家质检总局动植检疫实验所负责起草，中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳山入镜检验检疫局中国进出口商品检验技术研究所参加起草。本琊分十要起草人：覃文、朱水芳、曹际娟、滑良文、窈红运、黄文胜、章桂明、徐宝梁、赵文军、董洁。本部分系百次发布的国家标准。1
1范田
转基因产品检测
核酸定量PCR检测方法
G[3/T19493的术部分规定了转基因产品中转基因成分核酸定量检测方法。本部分的规范性附录规定了不同转基因品种和品系核酸定量检测方法本部分期定了转基因敲分经对含量和相对含量的计算方法。GR/T 19495.5—2004
本部分适用丁食品、间料、种子及其环材料中转基因成分的实时荧光PCR定量检测本部分也适压于转基因产品中转基因成分定性PCR检测阳性结果的确证检测。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/1 19495的本部分的引用而成为本部分的条款，以是注日期的引用义件，其随后所有的修改单（不包括勘识的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励报据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件：其最新版本适用于本部分。
GB/T19295,1—2004转其因产品检测通用要求和定义
GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3—2004转基因产品检测核酸提取纯化方
GB/T19495.42004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法3术语、定义和缩略语
本部分采下列术语、定义和缩略语。3.1术语和定义
GB/T 19495. 1 确立的以及下列术语和定义造用于 GB/T 1.9495 的本部分。3.1.1
检测低限limit of deteclion,LOD在假阳性结果不超过5改的条件下，检测方法所能检测的最低浓度和含量。3.1.2
外源基因
cxogcnnns gene
私用生物工程技术转人的其伪生物基因，使该生物品群表现新的生吻学性状。3.1.3
阳性标准物质positivereferencematerials自认可机构制备、有溯源性的关经检测证实含有不同浓度目标序列的物质。3. 1. 4
阳性标准分子，positivereferencemolecules内认可机构制备、有源性的含有准确目标序列的质粒3.2缩略语
下列缩峰语逻而丁不标准，
GB/T19495.5—20C4
3. 2. 1 Adh1-IVS6:Maize sleoholdebycroger.zsel genc No.6 intaon,玉米乙醇合放酶基因= 翁 6号内含子，
3.2. 2Cfs;Conversior. faclors,采用阳性标准分子进行转基因成分定量和采,用转基因作物阳性标准物贡违行窄量的转换系数。
3.2.3hsp/0-in:Maizeheat snocsprotcir75,玉米热休克蛋白（bs270)基因的内含子3.2.4OTP:Opim:xcd transit peptide,优化运输肽基因,3.2.5pepc intron:Phosphoenolsyruvaicarhoxylas gene intror，磷酸烯醇式丙甄酸酸化酶基因内含子
3.2. 62SsHb Msize starch synthase IIb,玉水淀粉合成酶 Ib.4防污染措施
按照GB/T19495.2—2004的规定执行5原理
核酸序列的PCR
PCR产物的检测以及确证的原理见GB/T19495.4+2004。定量一般是柜对含量是指两个所检测月标核酸绝对含量（Ig数或拷贝数）的比值（通常采用Ⅱ分比），例如检测的外源基因序列的绝对含量（ng数或拷贝数）与内源基因序列的绝对含量（ng数或考贝数)的比值。
核酸定量检调可以采用实时定量或PCR产物的终点定量·前者如实时荧光PCR，后者如竞争性 PCR。
实讨荧光PCE定量途视是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还增加了与模板DVA匹配的两端有荧光基随精记的深针。PCR每进行一次循环，合成的新链数与释效的荧光基团数呈对应关系，的PCR产物的量
与荧光信号的强度呈对应关系，当荧光信号超过所设定的康值（Thrcshold-value）时.炭光信号可被检测出来，比时所经历的PCR循环数称为C值。C,值与模板起始考贝数的对数呈线性关系。在检测未知含量的样品时，以C.值为纵坐标、以阳性标准物质(含量）或组性标准分子（拷贝数）的对效为横坐标绘制成标准曲线，只要获得测减样品的C值，利用标准曲线计算
该品中日标核酸的绝对含量，
6试剂
除另有规定外，所有试利的等级和要求应符合木标准规范性附录和GB/T19495.2一2C04中的规定。如去明确规定的，试剂应是分子生物级的，所有试剂的储存和使用应符合供应商和实验室的要求。7主要仪器设备
7.营现分子生物分析仪器
7.2实时荧光 PCR仪。
7.3化学PCR反应管和(或)96孔光化学PCR发应级，8检测
8.1一般性要求
本标准各附录现定了不同转基因品种和品系的定量PCR检测方法以及各自的适用范围。测诚样吊中2NA的凝取和定量立按照GB/T19495.3-2004中的规定执行。每个实验室栏品应制备两个测试样品提取 L)NA(捉取至复）。被测的目标核酸置应在标准由线范围内。GB/T 19495.5—2004
标准也线的质量影响度量的不确定性。标准曲线上的每个淤度应做2个立行（如4个浓受梯度，每个浓度做2个平行)。
每批测试实验需设置对照。对照的设置应符合GB/T19495.220C4中的规定。所有对照的结果中若有一现不符合者测试结果应放弃并重做实验。两个重复的测试样品测试结果（转基因成分含量）的相对相差大于或等于35%，测试结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做实验。注：相对相差－αl
第一个测试样品拍检测结果，
篇二个测试样品的检测结果；
a 和b 的尽均激。
8. 2定量 PCR 检测方法的型类
根据测战样品的炎型和（或）分析检测的要求，转车因产品的定量PCR检测分为：物种特异性内源基因检测、筛选检测、结构特异性基因检测和品系特性基因检测。物种特另性内源参期基因检测可判定是否有足够的DNA用于转基因定量分析检测，尤其造合测试样品为几种物种的混合物和深加工的食品。9结果分析与计
9.1单一组分样品中转基因成分含量的计算单一组分样品争转基因成分含量的计算分别见本标准的附录人至附录G9.2含有多组分或多品系样品中转基因成分含量的计算出彩经分（
每人组分如
钟组成的食品和饲料，应分别计算各组分的转基因成分含量果检测出多个转基因生物品系，该组分中转基因成分的含量应是所有品系含量的总和。注：多纸分是指加直食品和饲料中同时含有多个品种，如：大豆、主米、马铃薯等。示例：某一待测样品经物种特异性内源参照基因证实含有3种组分（组分A、组分B、组分C)。和品系 2:组分 R的量量因定量检测在检测低限以下:组分 C 检出品系 3、品系 1 和品系。。组分A检出品系1
各组分转基因或分含量的
算为：
组分A：转基因成分
一品系 1的拷其数士品系2的拷贝救×100%组分4的拷贝数
组分B：转基因成分含量纸于
于检测低限
系！的考贝数|品系2的持贝数|品系3的接剪效×100%组分C：转基因成分含量
10结果表述
10.1定量结果的表述
组分C的拷贝数
定量检测结果有4种背况，每种稳测结果应表述如表1表1定量结果的表述
检测结果
未检出物种内源特异性基区
检出物种内源特异性基因,但末检出目标外源基因片段检出物种内源特异性基因和目标外源基因片段，但含量小「定量方法检测限(标曲线的最浓值）结果裴述
该样品未检高×物种内源特异2NA成分该样品未检占转基因成分，定量方法检测限为×%该样品中X×转基因成分低「本定量方法检测限（×%）3
GB/T 19495.5—2C04
检测结果
表1（续）
检出物种内源特异件基因，于标外源基固含量在标准曲线范肃内
10.2定性结果表述
未检出义×转基因成分,检测低限为×军。结果轰述
3 在组分A中.xx转基因成分为x%；若生多个组分中检出转基内成公,应分别报告每个组分的转基因成分含量组分A的××转基因成分为X%、组分E的×转基因成分为Y%”
检出×义转基因成分，检测低限为×%。如果逊行了品系检测，可泄一步报该测试样品是×义转基因品系。
测试报告
测试报告应包含 GB/T 19495.1--20C4和GB/T 19495. 42004中规定的内容,还应包括：定量检测方法的依据；
核骏提取方法的依据；
本部分第15 章中的内容。
A.1范围
附录A
（规范性附录）
转基因大豆 GTS-49-3-2实时荧光 PCR检测方法GB/T 19495.5--20C4
本附录规定了转基因大豆GS433-2实时荧光PCR定置检测方法。本附录适用于食品、饲料、种子及其环境材料中转基因大豆GTS-40-3-2成分的实时荧光PCR定量检测
本随录也造用丁转基医产品中转基因大豆 GTS 4C 3-2 成分定性 ICR 检测阳性结果的确证检测A.2原理
采用实时荧光PCR技术和可综导性扩增转基因大豆GTS-10-3-2中结构基因或品系综异性基因以及大豆Lectin基因的引物和两端标记荧光的换针，分别扩增测试样品DNA，并实时监测PCR产物：与此同时,用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分了）,以获得稳定的标准由线：根铝外源基因（结构特异性基园或品系生特异基固）和内源基因的标准由线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度）：并由绝对含量计算转基因大品GTS-40-32在测试样品中的相对含量，如采用阳性标准分了时详算相对含量应使用转换系数、A.3检测
1. 3. 1 结构特异性基因检测
A, 3. 1. 1 方法 1
A. 3. 1. 1. 1 检测基因
本方达检测转基因大豆GTS 40-3-2结构特异性基因(CTP与 CPL EPSPS边界床列)和大豆内源Lectin基因，
A, 3. 1. 1. 2定量检测低限
本方法的相对定量检测低限为0.1%。A, 3. 1. 1. 3 主要试剂
4.3. 1. 1.3. 1引物和探针
以转基因大豆G:TS 40-3-2结构特异性基因及人豆内源 Lectn基因所用引物片列科探一I列则表A.1
表 A. 1检测转基因大豆 GTS-40-3-2 结构特异性基因的引物序列和探针序列基因
Lectin
正间引物5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'友向引物
:-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3:5'-FAM-CAA GCI GAC TCT AGC AGA TCT TTC-TAMRA 3正向引物
5*-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3
反向引物
5 GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-8'-FAM-CTT CAC CTT CTA TGC CCX: TGA CAC-TAMRA-3:注i.FAM.6-carboxyfluoresccin,rAMRA,G-ca\boxyle.rune hylrhodaun:se注2：结构特异性基因扩增片段长度为74bu,Luet:扩增片段长度为74 bp。PCR反应体系终浓度/
(rmel/L)
CB/T19495.5-20C4
A. 3.1. 1. 3.2 反应体系
实时荧光PCR反应体系见表A.2。表A.？实时荧光PCR反应体系
总反应运积
DNA模校(≤200ng)
j TagM. Universal Maser Mixax>正白引物和反向引物
注: ROX-carboxy-X-rh
加人量25 μL
成分：大豆基因组 DNA
成分：
1) Tu4-NA-Polymera2e;
2) dUTP urecil N-glycosylase;3）度应缓冲液（合ROX)
4) dNTP mix。
见表A.1
加人量：5
加人量：
TegMar Universul Med
Mix是由AH公司提供的产品的商品名给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该方品的认可。如果其他等效产品具有恨同的效聚，则可使用这些等效产品A, 3. 1. 1. 4 反应参数
5-403-2中结构特异性基的实时荧光PCR反应参数见表A3检测转基因大豆
L云冷染
活化DNA合成酶和
PCR(4E个循环)
表A.3实时荧光PCR反应参数*
时问，s
温度门
A3: 21ism 770c
DS仪器的皮虚参数。给出这一信息是为了方便本标准的使月者，不代表对该产别的以可，如果其他
A. 3, 1. 1,5 结果计算
品具有相局的效巢则可使用这些等效产品。结构特异性基因的绝对含量，可按式（1)计算其在测试样品中的相根据转基因大豆 GTS-0
对含量：
A. 3. :.2 方法-2
转基因产甜的含量（%）
A. 3.1.2、1检测基因
测试样品中结构基因的拷贝类
测试样晶牛肉源基因的接贡轰×100+++++++( A.1)
本方法检测转基因大豆C:TS-G-3-2结构特异性基因(CTP与CP4EPSPS边界序列）和大互内源Lectin 基因。
A.3.1.2.2定量检测低限
本方法的绝对定量检测信限为2℃个拷贝.相对定量检测低限为9.1%A.3.1.2.3主要试剂
4.3.1.2.3.1引物和探针
检测转基因大豆GTS-40-3-2结构特异性基因及大豆内源Lectin基固所月引物序别和探针序列见表A.4。
Lectin
GB/T 19495.5—20C2
表 A.4检测转基因大豆 GTS-40-3-2结构特异性基因的引物序列和探针序列名称
正向引物5'-CCTTTA GGATT CAGCATCAGTGG3反向引物5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3”探针
正向引物
没向引物
5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA AIC C-TAMRA-3'5/-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3'S-GCC CAT CTG CAA GGC TTT TI-3'3'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC TAMRA-3'注l：FAM.6-earboxyfluaresc
i,TAMRAG-ca.boxytetamechyirhodamine注 2: 结构特异性基因扩增片段良度为 1.21 bp, L.estin 扩增片段长度为 Th hp。A, 3. 1. 2. 3. 2 反应体系
实时荧光PCR反应体系见表A.5
表A.5实时荧光PCR反应体系
总反应体积
DNA模坂(50 #g)
TagMan Universal
上向引物和反向引物
注：ROX=carbor
Mix(2x
K-/odmine
加入量：25楼
成分：大豆基因组DNA
成分：
Tag DNA Polymera
2)aurp uracilNgiycesylese:
）反应缓冲液（含R)X）
)NTPmix
PCR反应体系终浓度
/(rmol/1.)
加人量2.3L
加人量：12.5mL
terMix是由AHI公司提供的产品的商品名。给用这一信息是为方便本标准的使用TaqMan Univer
冬，并不代表对该产需助认可。如果其他等效产品只有相同的效果，则可佳用这些等效产品。A.3. 1.2. 4反应参数
实对荧光PCR反应参数见
AG实时荧光PCR反应参数
活化DNA合成酶和磺变性
PCR:4个循
时间7
温度/℃
ABIPrism7700/7900SDS仪器的反应参数。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的以可。如来其他等效产品具有相同效果，则川使用这些等效产品，A. 3. 1. 2. 5 含量的计算
根培转基园大互GTS-20-3-2结均转异性基压的纯对含量：可族式对含量：
转基因产品的含量（%）：
A.3.2品系特异性基因检测
表.3.2.1检测基因
测试样品中结构基因的拷员数
测试详品中内源基因的拷贝数
........A. 2
本方法分别检测转基因大豆GTS-40-3-2品系弃性基因（大豆基因组DNA与GTS-40-3-2品系特异甚因之间的边界字列)和大内源Letix拿因。A.3.2.2定量检测低限
求方法的绝对定量检测低限为 40 个~-1G0 个拷只。A,3.2.3主要试剂
A.3.2.3.
引物和探钙
检测转基医大豆。GTs 4032品系特异性及大豆内狐Lecin基因的引物序列和探针序列见表A. 7、
表A.7检测GTS-43-3-2品系特异性基因的引物序列和探针序列基达
正向引物
S'-TAG CAT CTA CAT ATA GCT TCS'反向引物
E'-GAC CAG GCC ATT CGC CTC A 3'E'-FAM-ACA AAA CTA TTT GGG ATC GGA GAA GA TAMRA-3'5°-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'正向引物
反向引物5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'探针
5'-FAM-CT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAG TAMRA-3'注：FAM;i-s&rbaxyluorescein.TAMRA:s carxixyletramethylrhcamine注2：结拍特异性基固扩增片段长度为85 bp,Lectin 抗增μ-段长度为 74 bpA.3.2.3.2反应体系www.bzxz.net
实时获光 PCR 反应体系见表 A. 8表 A. 8实时荧光 PCR 反应体系总反应伍积
DNA模饭
TagMan U:ivursal Mester Mix(2x)*正向引物和反向引物
注：ROX=carboxy-X-rhodrn...
如人量：25ul
1）正准标准物质DNA模板≤250ng；2) 测试样品 DNA 最大量为 20C ng。虑分
) TOA-DNA-Polyintce.se;
2) dt'TP sraeil N-glyzosylase3)反应级冲（含ROX)：
4) IATP mix.
见表A.7
见表.？
PCR反应体系终泌度
/(nmol/.)
加人量:2. 5 μl
加人量：12.5ml
aTagManUniveral Mater Mix定店Atil公司提供的产品的商品名。给台这一信息是为了方便人标准的使用老，并不代表该产品的认可：如果其他等效产品真有和问的效果，则可使用这出等效产品。8
A.3.2.4反应参数
实时荧光PCR反应参数见表A,3。表A.9实时荧光PCR反应参数
去污翼
活论DNA.台成酶和预变件
PCR(25个坏）
时间/
GB/T 13495.5—2004
AIr Prism 7750/790C SI)S仪器的反应参数,给出这一偿患是为了方使本标准的使月者,并大代,表对该产品的认可。如果其们等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品，A. 3.2. 5
结果计算
振据转基固大豆 GTS-40-3-2 品系特异基因的绝对含量,可按试(A. 3)计算其在测试样品中的相对含量：
转基刚产品的含量(%）=测试格是中显素疗异性基因的持贝整×100试样品中内源基因的拷贝数
....-A.3)
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