【国家标准(GB)】 转基因产品检测 实验室技术要求

规范性引用文件
术语、定义和缔略语
转基固产品验测的工作流程
测试样品的费求
S转基因产品检验实验室的分区要求7
实验室质量控制和质量保证：
8实验室清洁
6有睾、有害及废弃物质的处理…[0安防护
附录A（资料性附录）
附录 B（资料性附录）
防止RNase污染的措施.
漠化乙锭溶液和含溴化乙锭琼脂糖凝胶块的冷化处理参考文献.
GB/T 19495. 2-2004
GB/T19495《转基医产品检测》为系列标准：GB/T 19495. 1—2004
转基因产品检测
GB/T 19495. 2--2004
GB/T 19:95. 3-2004
转基因产品检测
转基因产品检测
-GB/T 19495.4-2004
转因产品检测
-GB/T 19495,5—2004 转基因产品检测」-GB/T 19195. 62004
转本因产品检测
-GR/T 19495.7—2004转基因产品检测GB/T 19495.8—2004 转基因产品检测本部分的除录A、附录B为资料性用录言
通用要求和定义；
实验室技术要求：
核酸提取纯化方法；
核酸定性 PCR 检测方法;
核酸定量 PCR 检测方法;
基因芯片检测方法；
抽样和制样方法：
蛋白质检测方法。
本部分白国家认注认再监督委员会提出并归口，GR/T 19495.2—2004
本部分由国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所和中华人民共和国广州出人境检验检疫局负责起言、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、卫生部临床检验中心、渐江大学和广西大学参加起草。本部分主要起草人：朱水芳、草文、陈红运、贯文胜、潘良文，内际娟、赵文军、金民，董海涛、李有志
本部分票首次发布的国家标。
转基因产品检测
实验室技术要求
GB/1 19495.2—2004
民通品电风利司
鱼式量用肤康用
火品刻自一迎好用
GB/T13495的本部分规定了转基因产品检测实验室总体技术要求利检验质量控制的基本要求。本部分适月以核酸习增技术和免疫学方法检测转基因产品的实验室，也适用丁基因工程等其他相关领域的实验室。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T19105的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注口期的引用文作,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而,鼓励根据木部分达成协议的各方研充是否可使用这些文件的晨新版卒。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分
分析实验率用水规格和试验方法（eqvS03696：187）GB/T 6682
GB1.930探作开改型效射性物质的辐射防护规定GB/T 154812000
GB/T 19495
ASTME 13
检测利校准实验室能力的通用要求2004转基因产品检测通用要求利定义997用冷冻、冷冻干爆和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动物和植物组织
的保存
3术语、定义和绪略语
GB/T19495.1确立的以及下列术语和定义适用于GB/T19495的本部分3.1术语和定义
critcaire
关键试剂
agents
在使用前经己知样品测试过的试剂3. 1.2
阳性标准物质positv reference materials击认可机构制备，有潮源性的含有不同浓度待测靶序列的物质。3. 1.3
阴性标准物质 negative reference materials自认可机构制备，有谢源性的不含有待测靶序列的物质。3.2缩语
DEPC Diethyl pyrorarbonate,二乙甚信慌酸盐创工
M馨主
：设业
都建##丰
佳通家国多安中
UNG酶Uracil N-glycosylase.尿啶DNA糖基化酶。蒙镇a身限多建4转基因产品检测的工作流程
转基固产品检测的工作流程为:实验室样品到样验收(确定是否具备检验的基本条件）→混样→获取测试样品→测试样品的制备(待检状态）→核酸和（或)蛋白等目标物质的提取→PCR实验（包括扩增动产物分析）和（或）蛋白质检测结果判定→结集表述：出具俭验报告，1
GB/T19495.2—2004
5测试样品的要求
转基因产品检测所接收的待检栏晶应置丁原始包装袭（或容器)巾.不能接从其他检测、检验等分山灾药样品，以避免群品间交义污染，6转基因产品检验实验室的分区要求6.一般要求
6..1设施和环境要求
用于转基因产品检测实验空的设施和环境要求尚符合GB/T154&1200C中的观定压于核跋检验的转基内产品检测实验室、有条件的它在所分隔的各工作区减设置缓冲间，缓冲间的压力为负压（或【设抽风畏置）与其相连的工作间为正.二作与缓间之讨官安装磁性连锁置。受实验场所限制而条件设学缓冲问的实验室.在对检测这或送行动能划分后、应模据不部分6.2凸的现定设置实验空的！方。非实验人点不应进人各实验【作区。不同功能的核检验主作这应是分隔独立的上作室，并有町显的标志，许区门不能自通：各区之间如果是紧密相，需安装物品传递舱存个工作区或的顶部成安装紫外灯·紫外灯的没长为24T安装数量为征0安装·支40W的紫外灯，灯与地的距离不宜超过2.0m三0.：n。6,1. 2 工作顺序
所有实验操作前在规定的文域造行，待检样品的流动成遵照转基内产品检测工作流的顺序，严格按单一方向齿行。
6.2实验室工作区域的设置及要求6.2.1核酸检验区
6.2.1.1试剂贮存和准备区
a）主要功能：原装试剂配制试剂的些存，所有试剂的配制与分装b）上作区域的压力要求：末没缓治间的试昶烂存和准冬区，二作区减为平压注意于项，当试剂经质检个督后，应将其分装广行备币，贴行试制的分装体积限法通常在实验室内一次测定所需的抗增反应数决定。用于增的试剂应冰冻必疗6.2.1.2样品制备区
十要功能：实验室详品的很样和测试样品的制备，a
b）工作区域的压力要求：未没缓汇间的品制备区，工位区域为负压或减压，可安装抖风系统。注意事项：此区应远离其他实验操作区；粉碎样品时的器血应单独使用，所用的器具在使用前应经过彻底清流并高压消寿：防止交叉湾染：称取的测试栏品应州益后内移至样品核酸到备区。
6.2.1.3核酸制备区
a）主要功能：核的提取纯化与贮存；核酸含量的浏定：测试样品1)VA的保存。b）工作区的压力要求，未没缓冲阅的核骏制备区，工作区域为负原或诚压：可安表排风系统。注意事项：已绝化的核骏应保存于一20%或8:1℃避免反复冻熟：阳性和别性标准物质DNA可调整至常用的使用浓度后分装产冷冻保存。6.2.1.4扩增区
主要功能：PCR扩增反虚述系的-判和模板为加人，核酸扩仰，a
h）工作区域的压力求：末设缓冲问的扩增区，工作区坡为负！或减玉，可安装科-风系统，）注意享顶：严格限制光关人员出人并减少在本区内走动：加样应作超净工作台（仕物安全柜）内进行，超净工作会的气流方向方选择垂流式，巢式PCR的第二次加样必须生此区进行，2
6.2.1.5扩增产物分析区
a）主要功能：扩地产物的测定。GB/T 19495, 22004
b）工作区成的压力爱求：关设缓冲间的扩增产物区，工作区战为负压或减医，应安装排风系统。C）注意事项：此区是最主要的扩增产物衍染来源，应远离其他实验操作区；使用PCR-ELISA方法检测控增产物时，脸使用洗饭机洗被：青实验仅果用全自动扩增检测仪(如实时荧光定量PCR仪),可将扩增区与势增产韧分析区合并为一个区。6. 2. 2 蛋白质检验区
6. 2. 2. 1蛋白质分离纯化区
本工作区域的动能是用于蛋白质的分离与纯化。蛋白质纯化应具备低温工作的场地，如4亡冷房和(或)层析柜等，
6. 2. 2. 2 蛋白质检测区
本工作区域的功能是蛋白质分析检测。6.2.3 其他区域
零身国面健
可设置洗涤消毒室[洗涤、消毒、制备纯水和/《或)双蒸水、制冰等7高速/超高速离心机室、低温/超低温冰箱室等。
7实验室质量控制和质量保证
7.1 人员　
绿开开
转基因产品检测实验室的人另应接照 GB/T 15481一2000中 5.2的要求，实验携作人员应具备良好的分子生物学专业技术操作规范7.2仪器设备
各实验区域应有专用的仪器设备：同一区或内的仪露设备，物品和工作服应有明显标记,避免与其他区域的仪器设备混用。
仪器设备的校准应符合GB/T 154S120CO 中5.5的规定7.3试剂
7. 3. 1 试剂要求
除另有现定外,所有实验使用的试剂等级应为不含 DNA 和 LDNVase 的分析纯或生化我剂。试剂的选购，验收，亡存应符合GB/T 1548T2000规定。实验用水应符合GB/T 6582-1992中级水的规格，去离子水的电阻应达到18.2 α。商品试剂盒应注明别货口期，对所收到的试剂章应按规定的贮存条件存液。对菌种,质粒、动植物细胞组织陷贮存与保管符合ASTME1342一1997的规定：7. 3. 2试剂配制
实验室配制的试剂应在容器上标期试剂名称、浓度.配制时间、保存条件、失效日期及配制者姓名所用试剂落液宜大本积配制、小体积分装后高压灭菌保存，不宜高压火菌的试剂应过滤（0.22um）除菌;PCR主混液，引物、深针成避免反复冻融7.3. 3试剂质量控制
实验室应确定关键试剂,并在使用前进行质量检测。关缝试剂色指:核酸提取试剂RNase.蛋口酶K.队性对照标准物质、阳性对照标准物质、T酶、各种限制性内切、引物、探针、菌种、和性质粒注：试剂质格包括么有儿活染·是否存在假阳性心使用弱阳化对照标准物质检测试剂的打增激具7.4防上污染
7.4. 1严格实验室分区
按部分6,2中的规定,对实验室进行功能分区，客区的！作服、实验用具和实验记录本应区分标记,不能混用。
GB/T 19495.2--2004
7. 4.2样品管理
送检样品的包装应完好并有明确的标识；在对实验室样品进行混样、测试样品的制备和称童过程中应避免交义污染，
7. 4. 3实验过程的质量控制
7.4. 3. 1 质控种类
7. 4. 3. 1. 1 实验室环境对照7. 4. 3. 1. 2 阴性质控对照
为）核酸提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管；b）PCR试剂对照:不含 DNA/cDNA模板的 PCR 扩增反应液试剂邮
海高有
c）阴性目标DNA对照：即为内源基因对照,是不含外源目标核酸序列片段的模板。可使用阴性标准物质，并与测抗品等同处理进行核酸提取及 PCR扩增7. 4. 3. 1. 3阳性质控对照
a）弱阳性对照：使用己知的易阳性样品作为阳性质控样品，马测试样晶等同处理进行核酸提取及PCR扩增；
b）阳性目标 DNA对膜:使用含有目标 DNA/KNA序列片段的阳性标准物质和(或)质粒7. 4. 3. 1. 4 PCR 抑制物对照在PCR反应体系中
否存在水溶性抑制物质
加入已知量和已知可扩增的DNA进行PCR反应，以检测PCR反应体系中是当PCR反应无扩增结果和定量PCR时宜设此对照，7. 4. 3. 2 质控的设置及要求
实验室质量控制的设置和要求见表1转基因产品检测实验室检测质控的设置及要求表
质量控制环节
核酸提取
核酸定量
FCR扩增
PCR习增
产物的检测
结愿判定
结果表述
推荐性
磁提取
空白对照
阴性质控
PCR扩墙 性目标
试剂对照 DNA欢照
强制性
α头方向表示质控开始垒终止的环节。b“/\表方在检测报告4应做指述。强制性
阳性质控
彩性回标弱阳性百标PCR邦制物对照阴件提
取对照DNA对照 序列双照
推荐性
遥制性
强制性
（当需要确
定检测低
限时则为
强制性）
摇荐性
(但当所有的 PCR
检测结果为阴性
时则为强制性;
旗体服
°各短对照的PCR检测结果与测试结果判完的关系见GB/T19495.—2004中9.2.送10个样品应至少设置1个核酸提取空白对照G
7.4.4 避免各类实验污染
7.4. 4.1避免扩增产物污染
GB/T 19495. 2-2004
在PCR扩增皮应液中加入UDG酶，并以&UTP代替dTTP可防止以前PCR扩增产物所致的遗留污染。
7. 4. 4. 2 避免 RNase 污染
防止 RNase 污染的谱施参见附录 A。7. 4. 4. 3避免操作过程污染
实时荧光PCR和总核酸杂交法可院止摄作过程的污染，尤其是实时荧光PCR是转基因产品检测实验室章要的防污案指施之一
7. 4.5 清洁
实验工作结贞后，应按本部分第。宣对实验室进行滑消和去污染。7.5 污染后的处理
对常见的实验不境冯染源可定期采用擦拭实验进行监测全七国动看后源局
长准量复仿劳维
M33E01
在实验适程中出现实验材科散落利(或)PCR产物外溅时.应立即按照本标准附录A中的规定进行清洁处理并作出记录。
无玲任何检验环而爱染，应对己作的检验污染源为止。
7. 6室间质量评价测试
吉果产生质疑并停正继续进行检验工作，直至消除凡对外开展转基因产品检测计出具检测报告的实验室：应定期参加国家有关法定部门组织的检验项目的室间质量评价测试，
8实验室清洁
8. 1 清洁方向
实验室清治应按转基因产品检测工作流程的厅向、依次从试剂吧存和准备区至样品粉碎区、核酸制备区、扩增区、最后到产物分析区进行。8. 2 清洁用具
不同实验区域的满洁用兵应固定，不能交叉使用，工作结束后应立即对工作区或进行清洁。8.3清洁方式
8.3.实验室空间
实验室室问应定具
进紫外照射
8.3.2实验台面和仪器设备的清洁实验结束后，实验台面超净作台宜用3%双氧水或10%次氧酸钠溶液（含有效氯1%/L）擦抵清洁;也可在擦试后再用紫外光照射,照射离应不超过 90 cm,照射时间直过夜。注；10%次氟酸钠和 3%双氧水应有使,前配制、配制好的溶波不宜长期存胶9有毒、有害及度弃物质的处理
9. 1 移液器吸头
使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液的容器内浸泡，浸泡时间不宜少于24h。9. 2 PCR 产物
含有FCR产物的所有液你及度齐物应放人含有mol/L盐酸（HCI)的容器巾浸泡，浸泡时间不宜少于 6 h;采用 PCR-ELISA 方法检测时洗板机洗板所产生的废液应收集至 1 mol/L 盐酸(HCD)溶液中.
GB/T 19495. 2—2004
9.3琼脂糖凝胶及电泳液
对合有EB或经EB浸泡过的琼指糖凝胶、电泳缓油液的处理参见附录B.9. 4 阳性样品和质粒
精城国公理水
阳性样品的处理应符合GB/T19495,1一20C4的规定。阳性质粒宜放人！mo1/L盐酸(HC1)溶液中浸泡,浸泡时间不宜少于 6 5;10安全防护
10.1紫外线
在紫外线下工作应佩戴具有紫外线防护坊能的均月镜利（或)防护问罩，并蓝蔽暴露的皮肤。紫外照射消毒后力于空气中臭氧富集，不宜立即开始工作，应在停止紫外照射30min居开始工作，有条件的实验室·可安装无臭氧紫处灯
10.2溴化乙锭
在接触溴化乙锭时应戴一次性猜类手套,实验操作宜固定在一定的区问、使用祖对固定的容器，10.3放射线
在做有放射性物质的实验操作时应遵照GB 11930 中的既定进行个人防护10.4细菌培养物
缅菌培养物及所接触的平血应在121℃,30 mn消奇后方可丢弃。出健好开台
出业出司
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附录A
(资料性附录）
国39元
花发啡
防止 RNase污染的措施
GB/T 19495.2--2004
处分电的新款出房
操作者在整个实验操作过祝中应戴口暨和手套。A. 2 玻璃器血的处理
20于大爽家8
分a品
玻璃器血常规洗净后+应用 0. 1% DEPC于 37℃浸润2 h,再月双燕灭菌水漂洗2 次~3次,121℃ 30 miz高压消毒后，250℃烘烤h以上或2090干烤过夜，A,3 溶液的处理
所有溶液应加 DEPC至 0. 0,%-~0,1%,室温过夜或室温下微力揽拌 20 nir然后 121℃,30 min高压消或0℃妞热1、惑供过夜
注：中于 DEPC在 T-is 溶液中极不稳定,因此,配制 Tris 溶液的水应预先附 0. 1关 DFPC 处理并高应消背,如此配制好的工r溶液再高监消游后方可便月A. 4 实验操作
所有实验操作应在泳浴中进行以降低RNese的洁性，A. 5 抑制内源性 RNase 的活性在实验虑始阶段使用 RNase 抑制剂。国便
#里商方#
盛里飞示
GB/T19495.2—2004
附录B
（资料性附录
溴化乙锭溶液和含溴化乙锭琼脂糖凝胶块的净化处理B.1溴化乙锭溶液的净化处理
B, 1. 1 浓度大于 0, 5 mg/mI. 的溴化乙锭溶液的处理B. 1, 1. 1氧化法
a）加水稀释漠化乙锭溶液,使衣度低于0.5 mg/ml;b）加人1×体积的0mo/高锰酸钾溶液，小心混匀.再加人1×体积的25 mol/1.盐酸小心混勾.于空温放置夏小时：
加人1×体积的2.5mnl/l.氢氧化钠，小心混匀后液可真接丢弃，B. 1. 1. 2 还原法
溶液，使液度低于0.5mg/mL；
加水稀释溴
加人0.2×
本积通5%次磷酸和0.12×体积的0.5n.ol/L亚硝酸钠（pH3.0%混匀：于室温h)
放置24 li；
加人过最路
注：5%次磷酸和
B. 1. 2 浓度小于 0.
每 109 znL
于室温改置
用Whatmal
(）滤纸和使用过
1/L的磁酸氢钠，混匀后溶液可直接丢剂/L业硝酸钠部应现月现配制。
mL的溴化艺锭溶液（电泳缓冲液）的处理中加入10cmg活性炭：
不时摇动；
滤纸过德溶液：滤液可自接丢弃：生炭可按本部分第13.2章的方法处理。B.2含腹化乙锭琼脂糖凝胶块的净化处理含溴化乙锭的琼脂糖凝胶快及其他固态物质的净化处理可采用获化处理方式，楚化的鼠度不应低于262℃。
参考文献
GA/T 382-2002法庭科学 DNA实验室舰范国家药品监督管埋局《药品检验所实验室质量管理规范（试行）》，2090卫生部《临床基因扩增(PCR)诊断实验室工作规范》ASTM E 548—1994用于评定实验室资格的一般性准则GB/T19495.2—2004
C.W.迪芬巴赫等（黄培堂等泽）.ICR技术实验指南。北京：科学出版，1998CEN/TC 275/WC 11N 181 Foodstuf(s-Nucleic acid based methods o: aralysis for genetical67
ly nmodified organisms anl derived products- Ceneral requirenments and defimitions[77ISO/DIS 15189医学实验室—质量和能力的特殊要求
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