【国家标准(GB)】 转基因产品检测 蛋白质检测方法

1CS 67. 050
中华人民共和国国家标准
GB/T19495.8—-2004
转基因产品检测蛋白质检测方法Detection of genetically modified plants and derived products-)a Proteinbasedmethods
2004-04-13发布
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
调蔬照红范镜
满文学
2004-04-13实施
GB/T19495.8-2004
事泰团团际次务人华中
规,范性引用文件
术语和定义
仪器设冬
结果的分析与表述
0影响检测结果的参数
验证方法
[2检浏报牛
.............
录 A(规范性除录）转基医植吻及其产品中 CP4 EPSPS蛋白的 ELISA检测附录B(规范性附录）转基因植物及其产品中CrylAh/Ac货白的试纸条测参考文献
1-PO-AOOS
总创量国品人
鼠医服管教寻定园
GB/T_9495转基因产品检测》为系列标准：-GB/T 19495.1-2004
GB/T 19495.2
C:B/T -9495. 3—2094
GB/T19495.4—2C02
GB/T 194S5. 5-—2C02
GB/2 19495.6—20C4
GB/- 19495. 7--20C4
GB/T 19495. 8-2004
转基因产的检测
转基达产品检测
转基因产品检测
续基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
转基国产品检测
转基因产品检视
木部分附录A、附录B为规范性附录，言
通用安求和定义;
实验室技术要求；
核酸摄取纯化方病；
核酸定性PCR检训方法：
核酸定量PCR检测方法：
基因芯片检测方法;
拍样和制栏方法；
蛋二质检测方法。
木部分由国源认证认可监督管评委员会提出关归口。本部分由中华人民共和国质量盛督检验检疫总局批准发布、GB/T 19495.8—2004
本部分起草位：上海市农业科学院，中国农业大学、中国农业科学院生物技术研究所农业部科技发展宁心、尽家质量监督检验检疫总片动檀物检疫实验所、上海交通大学，中华人民共和巨上海心人境检验检疫局、华南农业大学。
本部分兰要起草人：张大乓、黄民仑、陆伟、爱虏、付仁文、米水芳、梁婉烘、贸军、潘良文、梅曼彤，
本部分系首次发布的国家标准。1范围
转基因产品检测
蛋自质检测方法
GB/T 19495.8—2004
GB/T 19295 的云部分适,用十以检测口标蛋白为基碚的转其固产品定性定量检测方法,本部分附录中列户的检测方运是以现有抗体为基础的检测方法2规范性引用文件
下列文件口条欣还过GB/19495的本部分的引用南成为本部分的条款。儿是注日期的引文行，其随后所有的收单(不包据期误的内容)或修订版均不逅用于本部分，然而，鼓励根括本部分达成协议的各方供究是否可使用疫
文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本部分。
GB/T 19495. 1
GB/T 19495. 2-
GB/T 13495. 7
3术语和定义
下列术语利定
3.1—般术语
基质martix
转基因产品检测通用要求和定义转基因产品检测实验室技术要求转基因产品检测抽样和制样方法于CB/T1949元的本部分
测试栏品中包盒被潜解或固定的日标蛋自的所有物质组分的混合物。3.1.2
蛋白质变性
denatuation of proteins
主于物理或化学等项使月标蛋白的结构受到破环或修饰：其功能、酶学性质或抗原性发生改变。3.2与抗体有关的术语
抗体antibody
B淋卫细胞对异源成分分子抗原)反应时产关分泌的免疫球蛋白，可与抗原特异性结合，3.2.2
抗原antigen
被免疫系统识别、并可激发免疫系统产生免疫反应的物质。3.2.3
克隆clane
来源二个单细脑系相间细胸。
交叉反应
cross-reactivity
抗体与目标蛋白之外药其他物质结合的现象。3.2.5
单克隆抗体
monoclonal antibody
辛对二个坑原洗定、从一个杂交痛细跑克降产牛的抗依，GB/T 19495,8—2004
多克隆抗体”polyelonal antibody针对多个抗原决定簇,由多个淋巴细跑克隧产生的抗体。3.2.7
抗体特异性spccificily or an antibody种抗体可专一地与一人抗原决定簇结合前不与其他抗原决定簇结合的能力。3. 3目标蛋白为基础的检测技术有关术语3.3. 1
偶联抗体conjugateantibody
与．酶或荧光物质结合的筑体。3.3.2
蛋白质免疫印迹
weslernblotting
从聚丙烯酰胺凝胶上将经过电泳分商的蛋自质转移到质松介质！旦标蛋白可被标记抗体特异识别的方法。
酶联免疫吸附分析ELISA enzyme linked iminunosorbent assay利月酶联苏和底物形成有颜色反应的产物的一种体外定量分标方法。3.3.4
检测试剂盒
testkit
用于捡测某特定成分的一组试剂的组合体。3.3.5
检测试纸条dip stick format
抗体或分析物包被在固相支长物表而，适会快速定性分所的则向流动试纸条。4原理
从测试样品牛接照一定的程序抽提出含有月标蛋白的基质,利用抗体与目标蛋白(抗原)特异性结合特性，追运得联抗体与抗原抗本复合场的作片产生可检测的信号。5试剂
除另有现定处.所有试剂的等级和真求应符合本部分的降录 A,附录B和GB/T 19195,2一2004 片的规定。如未明确现定的，试剂应是分子生韧级的。所有试剂的储存和使用应符合供应商和实验室的游求。
6仪器设备
6.1搅拌器。
6.2分浆器，
6.3冷冻离心机(4 000 g～10 000 g)。6.4酶标仪，
）取样
按照GB/！【9495.7”2004中的观是热行。）由指单位是供，给出这一借息是为了方便本部分伤侵用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有循的效果，则可使H这出等效产品。2
8程序
8. 1 一般要求
抗体、偶联抗体、底物等的亡条件知保质期应与生产商要求致。G:B/T 19495.8—20C4
为了实施本部分应注意实验室的质量保证（如有关仪器的校准、两次视.定、空白、标准质的使历、制作标准油线等）认真清洗与样品直接接触的所有仪器，以防污染。8.2样品溶液的准备
称取适量有代衰性的分析样品二聚两管中，其甲一部分用于聋自质油提，加人拍提液，匀浆或混勾.制备栏品溶。对于店休等不能直接测试的样品，经磨萨,搅栏等处理底进行测品。粉木、面粉有膨张特性.有时需要目两倍体积的油提液。脂肪含量高的实验室样品需要抽提较人的测试样本。8.3 蛋白质扯提
选用适于特定基质的抽提方法。测试样品或标准品的抽提和稀释等在附录单面有详细描述。应使用聚丙烯管批提蛋白，以避免蛋白吸附，在捆烧和分新时倬而相同的缓冲液，以尽可能藏减少基质对检测的影响·抽拆缓冲液应保证最人量地从样品中油提出目标蛋白或分。8.4标准曲线的制作
使用与基质一致的阳性标准品制作标准由线。8.5 分析程序
按照圣部分附录所列程序，根据空白对照、阳性际准品，创性标准品及测试样品的数量选取适量的检视试剂，将.试测样品的溶液稀释到适合分析的浓度。根据所选方法，轻轻混勾，使反应在规定的时间和落度范围内进行·根据附录所述方法终止反应，及时读出检测数值
9结果的分析与表述
9. 1—般要求
重复测定同一样品的吸光值的差异不得超过15与，算所得的浓度差异不得超过20为。如果超过变异系数分数的「限，必须重新选取样品检测.重复3次以上。检测结果不能表述为在栏品中无转求医成分，
9.2定量分析
需要分析下列参数：
空白列照、阳性标准品、阴性标准品及测试栏品的原始数据；重复或验的变异系数而分值；
阳性标准品的变异系数汽分；
对照样另的变异系数而分值。
所有最后检测结采在报告时都必须号虑检测方法的不确定度定量结果应根据在性标催品线性范围内的测量值来计算。9.3 结果的表述
定性检测结息表述：
阴性缩果：“在检测限时末检测到文“或“于检测的限时术检测到>”阳性结果“在检测下限时检测到”或“高于检测的下限时检测到”。定量检测结果衰述：
低于定量下限的阳性结果：“阳性,高于检测下限,汇低于定量下限”高于定量下限性结果“在检测下限时检测到，含量为\或“高于检测限检测：含量为\
GB/T 19495. 8—2004
10影响检测结果的参数
每欲测诚样品得到的实验数据，应与试对盒的各种参数的标准查行比较：以保证检测结果的可靠性和一致生，当检别的数值与试剂盒提供的齐种参数不--致时,说明这个检测结果不准确.需进一·步对这些检测数据进行验证。
1C. 1 交叉反应
检测个定的目标蛋白,需分析其在不词基负中反应的特异性。可以用日标蛋自的类似物即具有相似序列的蛋白来许价交叉反应，同时也要对含有成分尽可能相近的非转基因样品违检验和较，1G.2基质效应
小同的据质所适用的免疫检测范国不同，应明确基质的应用范用.月与基质框一致的标择品，制作阳性标准品的稀释内线，用于测试样品的定量检测，标准曲线的形状不应因基质效应而改变。如某样品与标谁品在不同的基质中进行检验，应考虑其质效应。10.3线性率
对十定望检测来说能
期确不同基质免疫分析线性范国。阳性标准品的检测数值在一定范围内应该是线性关系；如果出现曲线，应该检测更多的阳性标准品，获得更多标准点制作标准再线，如采曲线斜率不相间，应对群品稀释和测试.并进行统计分析11验证方法
如果对检测结果出现异议，可以用定性或定量PCR检测方法验证。S
12检测报告
检测报告至
包含以下信息：
美品的信息：
实验室
标明是定程戴定量检测方法，
定性检测下限；
最高或最低
样日期
一收栏日期：
检测日期：
量检测的下限；
测试样品的数量
检测结果及所采月的数量单位：在检测早竭察到的异前现象：
可能对检测结果有影响，但在方法中未提到的操作或其他因款A，1适用范围
附录A
(观范性附录）
转基因植物及其产品中 (CP4 EPSPS蛋白的FLISA检测GB/T19495.8—2004
本翁衣规定了转基丙大豆及其初级加工产品巾CP4EPSPS蛋自的ELISA方法，也适用于含有CP4 EPSPS蛋白的其他转苯因植物检测。A.2原理
用直接酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测CP4EPSPS蛋白的原理如图A.1至图A,1所示：-单克隆抗体，
包被表面。
注：醇标板衣画被有特异的单克隆铺获抗体S
抗原：
包莜表面
注：当加上测试模品时粘获抗体与抗原结合，来绪合的样品成分通过洗涤除去图A.2
辣根过系化酵；
一检测抗运：
一包被表而.
注：洗涤之后，加入与媒振运氨化物偶联的多克案抗体，该抗位可与CP2EPSPS蛋自的力一个扩原衰位特异结合。图A.3
GB/T 19495. 8—2004
包被表面，
：院净之层,加人辣根过年化物酶的显色,低物匹中基联本度，HRP可欲化底物产生颜色反应，颤色信号与抗原浓度在完范国内上线性关系。显色一定时间后，加人终止液终止反意。右450#m波长测每一孔的光密度。图A,4
A.3试剂
A.3.1检测试剂盒通常提供的试剂A.3.1.1大豆油提缓冲液：硼酸钠缓冲液，pH7.5A.3.1.2大豆分析缓冲液：磷酸盐缓洲腋：Tween-20，BSA，pHI7.1。A.3.1.3包被有单克隆捕获抗沐的游标孔。A. 3. 1. 2
与辣根孕氧化物酶偶联的免范，A. 3. 1. 5
泻猴抗沐稀释剂：19杀热火活的小鼠血清。A. 3. 1. 6
显色底物。
4.3.1.7终止液:0.5%硫酸。
A.3.1.8二0倍浓缩的洗淤缀汁液:PBS,Tween-2C，pH7.1与基质匹配的阴左和阳性标准品-如0.1%，0.5%，1%，2%，烯。A. 3. 1. 9
A.3.2其他需要准备的或剂
A.3.2.！70%的甲醇溶液（积比）：取700mL甲证水定容至14.3.2.295%的乙醇、
A.4仪器设备
通常实验室仪器设备。
A.4.2酶标仪。
A.4.3孔经450μIn的滤膜。
A.4.4孔径150 μr的滤膜。
A.4.5多通道移液器。
A.5操作步骤
A.5.1样品的预处理
取5C0息以上人臣，粉链、微了，滤膜过滤。在作过程中小心避免污染，避免高部过热，楚性检测的微孔滤膜孔径应为450uY,保证孔径小于45℃um的粉末质量占大豆样品质量的90%以上。定量尬GB/T 19495.8-—2304
测的样品先用托径为450um的微孔滤膜过滤后，再经孔径为150url的微孔滤膜过滤，这滤得到的样明量只要能满足检测案求即可。对于其他类型的材料采用类似的方泌处理，在检测不同批次样品之间应将处理大豆样品的所有设餐迹行视底洁。首先，尽可能除去残留材料，然后用酒精洗涤两遍，用水彻底清洗，风干。可时，工件区应保持澄法，避免烊品交叉污染。A.5.2祥品抽提
测试样品、阴生及性标准品在相同条件下抽提两次。每种标准品在称量时按照含量由低到尚韵享进行。
将每一种样品称出0.5g士0.01·放人15mL聚两烯离心管中，为避免污染，在孩量不同栏品时，用精棉擦干净药匙并晾于，或使用一次生药匙。向每个离心管中加4.5mI.抽提缓冲液。将缓冲液与管内喇质刮烈记勾并旋涡振萄，使之成为勾-的混合物（低粉木和分离蛋自质需延长混含过问.有时超过1rin；全胆粉末睿易混勾，六超过5 mi)
45000g离心15toin.
小心吸取上清丁另一千净的聚丙烯离心管中，每管吸取：上清液。上液可于2℃～8℃贮存,时问不超过241。
在检测前,用太豆检测缓冲液按烈表 A.1所列比例稀释栏品辫液。表 4. 1 不同基质的稀释度
脱胎豆粉
分离蛋白
A.5.3ELISA操作步骤
度.5.3. 1孵育
释释度
：300
在室源下，取出酶标板，加100ui.释的样品溶液及对照到醇标孔中.轻轻混勾。37℃孵育1每次加应该更换一次堂吸头，以免交叉污染。并使用胶带或铝箔封位酶标板，以免交叉污染和蒸发）。A.5.3.2洗涤
把10倍浓缩的洗终缓冲液用水烯释10倍，用洗涤工作液洗涤酶标板3次，在此过程中，不要让酶标十，否如会影响分析结果；不管是人工洗还是自动洗涤，应确保每孔用相同体积能荒液洗涤，以免出现错误的结果。
人工洗涤:将萄标板避转，倒山微引内液体。用装有洗涤工作滋的50C mT.选瓶，将每孔注满洗漆液，保持5，然后麟转,倒掉洗涤渡。如比重复操作总共3次。在多层纸巾二将酶标板倒拍数饮，以去除残（用胶带将的标板条定以免滑游)。当动洗涤：野育完毕，用洗极机冷所有孔中的液体吸出，然后在每孔内加满洗漆液。女此重复3次。最片，用洗板机吸出所有孔十洗涤液，在多悬纸向上将酶标发效拍干，以去除残液。4.5.3.3加入偶联抗体
根据使用说引，用偶联抗体结合稀释剂溶解抗体粉末得到抗本购存液，于2℃~8么贮存。双243μl.偶联抗体监存液.加人到21ml.倡联抗体释释剂中彻到联抗体工作液，丁2°！~8℃购：有
在每子，中加100μl.偶联抗体工作液，封闭酶标板，轻轻摇晃混勾，37℃浮育1hA.5.3.4洗涤
洗涤方法问 A.5.3. 2.
GB/T19495.82004
A.5.3.5 显色
每孔中加人100L显色底物，轻轻播动酶标板，室温孵育1Crin(加显色底物时应连续一次完成.不得中断，并保持相同次序和时间间罚）。A.5.3.6终止反应
按照加入最色底物同详的顺序向标孔中印人100u终止液，轻轻据动酶标放1C5.以终止颜色变化，介使终士海在孔中均句分布（在加人终液时应连续一次完成，不得中断，酶标板应注意避光，院止额色深浅因受到光的影响而发生变化。A.5.3.7吸光值的测定
在1人整止液39min之内用酶标仪在450nm波长测量每孔的吸为值(OD)：记录所得结果，用计算机软件处理A.6流程图
蛋白质抽提流程见表A.ELSA实验流程见表A.3，表A.2
加缓冲液
测量吸光度
蛋白质抽提流程
洋纠说明
#量0.测试样品，空白、参期标准重提缓冲液4.3.1.1)4.5ml
式样品与拍据缓冲波充分混，高脂模求低于51min，低脂榜术、分离驾口质5min以上。以6oc0g将碰品高心1sni=，吸政上清液到另于净离心管中基质不同以
100 μL
300或1：10稀释，稀释测试
品溶液、空白、阴性利阳性标品：表A.3ELISA实验流程
细说朝
微量移液器吸放已稀释的样品济液空白，阴兰私阳性标准品至相应醇标孔。37℃孵育h
用洗涤缓冲液（A.31.8）洗涤3次个酶标孔中加人偶联抗体（A.3.1.4）孵h
用洗降象冲液（4.5.1.5）洗涤3次。内每个酮标孔中加人显色底物（A.3.1.5)，室温孵育10i
向每个酶孔中加人终止液（A,3.1.7)轻轻混句10 s。
用酶标仪测量每孔市450mz的吸光度，测试样品中目标蛋白浓度的计算测试样品及参照标谁的数值需减去空白样的数值，所测量的阳性标隆品的乎均值用生成标准曲线，测试样品的平均值根据标准曲线计算相应浓度。A.8结呆可信度判断的原贝
GB/T19495.8--2034
对于阳性标谨品（大豆种子）而言，该方法检测的灵敏度必须保证在0.1%以上，定量检测的线性范围是 3. 5%-~3%。
氢轮检测都必须符合表A，4所列的结果可信度判断的原则。每一轮反应应当包措空、防性标品、阳性标注品和测试格品。所有样品检测液、空白对照都必须设置一个重复。如果不符合表A.1中所列的条件，所有检测实验需重新操冶。表A.4
结果可信度判断的条件
空自烈照
性标准品
2.5%阳价标准品
所有阳
才知样晶、裤液
ODsn rm 0. 30
OD50 ma0. 30
ODm≥0.8
画复的OD假差异15%
重复的V159
重复的CV20%
重复的添魔值差身5%
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