【国家标准(GB)】 SPF鸡 间接免疫荧光试验

GB/T17999.9—1999
鸡传染性贫血（CIA），是近年来新发生的鸡病，国外均对其进行监测。CIA在我国鸡群中也有流行，因此，SPF鸡微生物学质量控制国家标准将其列入监测项目。目前国内已建立了SPF鸡监测CIA的通用方法---…间接免疫荧光试验（IFA)，该方法已得到应用和验证，在此基础上制定本标准。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡间接免疫荧光试验》。SPF鸡微生学检测方法还包括以下部分：GB/T 17999.1—1999
GB/T 17999. 2—1999
GB/T 17999.3—1999
GB/T 17999. 4-—1999
GB/T 17999.5--1999
GB/T17999.6—1999
红细胞凝集抑制试验；
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
GB/T 17999.7---1999 SPF鸡
GB/T 17999. 8---1999
SPF鸡
血清中和试验；
血清平板凝集试验；
琼脂扩散试验；此内容来自标准下载网
酶联免疫吸附试验；
胚敏感试验；
鸡白痢沙门氏菌检验；
试管凝集试验：
本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口，本标准起草单位：北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人：周文平、赵立红、陈德威。93
1范围
中华人民共和国国家标准
SPF 鸡
间接免疫荧光试验
SPF chicken-Indirect immunofluorescent assay本标准规定了间接免疫荧光试验试剂、材料、操作程序及结果判定等。GB/T17999.9--1999
本标准适用于SPF鸡感染鸡传染性贫血病毒（ChickenInfectiousAnaemiaVirus，CIAV)后的抗体蓝测。
2原理
间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧光，因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗原及荧光色素标记的抗抗体检测相应的抗体。
3试验和器材
3.1试剂
3.1.1阴性、阳性血清。
3.1.2被检血清。
3. 1.3 PBS(0. 01 M、pH7.2)。3.1.4FITC-免抗鸡IgG(按说明稀释使用）。3.1.5缓冲甘油。
3.2材料
3.2.1湿盒。
3.2.2培养箱。
3.2.3荧光显微镜。
4操作程序
4.1感染细胞的制备
用MDCC-MSB-1细胞制备鸡传染性贫血病毒感染细胞及未感染细胞（病毒培养技术参见有关文献）。
4.2抗原片的制备
4.2.1收集培养48h的细胞培养物，1500r/min离心10min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物三次，以少量 PBS重悬细胞
4.2.2取10uL细胞悬液（含细胞105个），滴加于镀膜印孔载玻片各孔中，同时制备末感染细胞对照片。
国家质量技术监督局1999-11-10批准94
2000-04-01实施
GB/T 17999. 9--1999
4.2.3滴好的抗原片用热风吹干，冷丙酮（4℃）固定10min，保存于一10℃，一周内使用。4.3间接荧光抗体染色
4.3.1取出抗原片室温放置10 min待用。4.3.2用PBS将灭活被检血清，阴性、阳性血清分别稀释成1：100、1：500两个稀释度，分别取10μL滴加于抗原片各孔中。
4.3.3将加样抗原片置于湿盒内，37C孵育30min。4.3.4用PBS浸洗三次，每次10min。4.3.5取20uLFITC-免抗鸡IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育、洗涤同前。4.3.6用缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。结果判定
CIAV感染细胞结构清晰，核内见清晰的荧光颗粒（未感染细胞中无荧光颗粒），判为阳性。95