【国家标准(GB)】 SPF鸡 酶联免疫吸附试验

GB/T 17999.5—1999
酶联免疫吸附试验(ELISA)是国外监测SPF鸡淋巴白血病病毒感染的通用方法。我国建立的淋巴白血病ELISA方法敏感性高、特异性强、重复性好，已广泛用于商品种鸡场淋巴白血病的净化和SPF鸡场淋巴白血病病毒感染的监测，本标准在此基础上，规定了 SPF鸡酶联免疫吸附试验。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡酶联免疫吸附试验》。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验；
GB/T17999.1-1999
GB/T 17999. 2—1999
GB/T 17999.3—1999
GB/T 17999. 4—1999
GB/T 17999.6.--1999
GB/T 17999.7—1999
GB/T 17999.8—1999
GB/T 17999. 9-1999
血清中和试验；
SPF鸡
SPF鸡
SPF 鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
血清平板凝集试验；
琼脂扩散试验；
胚敏感试验；
鸡白痢沙门氏菌检验；
试管凝集试验；
间接免疫荧光试验。
本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位：农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人：陈德威、张冰、赵立红、黄进、李军。80
1范围
中华人民共和国国家标准
酶联免疫吸附试验
SPF鸡
SPF chicken--Enzyme-linked immunosorbent assayGB/T17999.5-1999
本标准规定了酶联免疫吸附试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染淋巴白血病病毒后的群特异性抗原的监测。2原理
检测SPF鸡蛋清中禽白血病病毒主要群特异性抗原P27的方法为双抗体夹心酶联免疫吸附试验。先用抗P27抗体包被酶标板，然后与蛋清作用，蛋清中的P27与包被抗体结合，洗去未结合的物质。再加入HRP-免抗P27抗体，作用后洗去未结合的酶标物。加入底物溶液，出现颜色变化。颜色变化的速度及程度与样品中P27的含量有关。3试剂和器材
3.1试剂
3.1.1包被抗体（兔抗P27IgG）。3.1.2阳性抗原（P27)。
3.1.3阴性抗原。
3.1.4被检蛋清。
3.1.5HRP-兔抗P27。
3.1.6包被液：
0.05mol/I、pH9.6碳酸盐缓冲液配制：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，蒸馏水加至1000mL。3.1.7洗涤液：
pH7.4、PBS-TWeen20配制:0.01mol/L、pH7.4PBS 1000 mL,吐温-200.5ml.。3.1.8底物溶液：
pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液-0OPD-HO,配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液25.7ml.0.1mol/L柠檬酸溶液24.3ml，蒸馏水50ml.，邻苯二胺（0PD)40mg，30%H,O,0.15ml。3.1.9终止液：2mol/1.硫酸。
3.2器材
3.2.1酶标板。
3.2.2移液器。下载标准就来标准下载网
3.2.3恒温培养箱。
3.2.4ELISA读数仪。
4操作程序
4.1抗体包被：用包被液将兔抗P271gG作适当稀释，每孔100pL，4C过夜国家质量技术监督局1999-11~10批准2000-04~01实施
GB/T17999.5--1999
4.2洗涤：甩去包被液，每孔加满洗涤液（约300uL），静置3min，甩干，如此重复3次。4.3加样：每孔加100μL被检蛋清，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，37C作用60min。甩去样品，洗涤同上。
4.4每孔加HRP-免抗P27（工作浓度）100μL，37C作用45min~60min，甩去HRP-兔抗P27液，洗涤同上。
4.5加底物溶液：每孔加100μL新配制的底物溶液，避光作用15min。4.6终止反应：每孔加终止液100μL。4.7读OD值：终止反应后，迅速置ELISA读数仪上于490nm处读出各孔的OD值。5结果判定
5.1当阳性对照OD值与阴性对照OD值之差大于或等于0.3时，试验结果可靠。5.2按式（1）计算被检样品的S/P比值：样品OD值均数一阴性对照OD值均数S/P=阳桂照OD值均数一荫程对照 OD值均数式中：S——样品D值；
阳性对照OD值。
5.3判定：S/P≥0.2，判为阳性；S/P<0.2,判为阴性。82
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