【国家标准(GB)】 SPF 鸡 琼脂扩散试验

GB/T 17999.4-1999
本标准是在我国建立的琼脂扩散试验（AGP)的基础上，并参照美国SPAFAS公司AGP操作规程编制而成。
SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡琼脂扩散试验》。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分：GB/T 17999. 1 ---1999
GB/T17999.2—1999
GB/T 17999. 3—1999
GB/T 17999.5—1999
SPF 鸡
SPF鸡
SPF鸡
SPF鸡
GB/T 17999. 6---1999
SPF鸡wwW.bzxz.Net
GB/T17999.7—1999
SPF鸡
SPF鸡
GB/T 17999.8—1999
GB/T 17999. 9—1999
SPF鸡
红细胞凝集抑制试验；
血清中和试验；
血清平板凝集试验；
酶联免疫吸附试验；
胚敏感试验；
鸡白痢沙门氏菌检验；
试管凝集试验；
间接免疫荧光试验。
本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位：农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主要起草人：赵立红、陈德威、张秀美、靳彦华、秦卓明。77
1范围
中华人民共和国国家标准
SPF 鸡
琼脂扩散试验
SPF chicken--Agar gel precipitation test本标准规定了琼脂扩散试验所用试剂、材料,操作程序及结果判定等。GB/T 17999. 4 -1999
本标准适用于SPF鸡感染以下病毒后的沉淀抗体的监测：禽流感病毒A型（AvianInflueza VirusType A）、传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus）、传染性法氏囊病病毒（Infectious BursalDisease Virus）、传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus）、禽痘病毒（Fowl PoxVirus）、马立克氏病病毒（Marek'sDiseaseVirus）、禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus）、网状内皮增生症病毒（ReticuloendotheliosisVirus）、禽呼肠孤病毒（病毒性关节炎）（AvianReovirus）禽腺病毒I群（AvianAdenovirusGroupI）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）。2原理
琼脂扩散试验是一种沉淀反应。抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二者互相结合，在最适比例处出现沉淀线。常采用已知抗原检测相应的沉淀抗体。3试剂和材料
3.1试剂
3.1.1琼扩抗原。
3.1.2阳性血清。
3.1.3被检血清。
3.1.40.01M、pH7.2、8%氟化钠磷酸缓冲液。3.1.5优质琼脂粉或琼脂糖。
3.2材料
3.2.1琼扩板。
3.2.2打孔器。
3.2.3移液器。
4操作程序
4.1琼脂板制备
1g优质琼脂粉或0.8g~~1g琼脂糖加入100mL0.01M、pH7.2、8%氯化钠磷酸缓冲液中（检测禽流感病毒感染时，同0.01mo1/L、pH6.4的8%氯化钠磷酸缓冲液配制琼脂），水浴加热融化，稍凉（60C～65C），倒入琼扩板内（厚度为3mm），待琼脂凝固后，4℃冰箱保存备用。4.2打孔
用六角形打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3mm~～4mm，孔距3mm。用8针头挑出国家质量技术监督局1999-11-10批准78
2000-04-01实施
GB/T 17999.4--1999
孔内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出。4.3封底
打孔完毕，封闭孔底。将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微溶化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量溶化的1%琼脂或琼脂糖。4.4加样
用移液器滴加抗原于中间孔，周围1、4孔加阳性血清，其余孔加被检血清。加样时应将孔加满，不应出现凹形面，也不应溢出。
4.5感作
将琼扩板加盖保湿，放于37C温箱内作用24h～72h，观察沉淀线。5结果判定
5.1阴性
阳性血清与抗原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5.2弱阳性
被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱陷性（需重复试验）。
5.3阴性
被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。79
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